慢粒靈制劑中青黛定性鑒別和紅花3 種黃酮類成分含量測定*

賈 勇，趙金秀

（河北省廊坊市中醫醫院，河北 廊坊 065000）

慢粒靈顆粒由三棱、莪術、青黛、山豆根、桃仁、紅花、黃藥子7 味中藥組方，具有活血化瘀、散結消的作用，臨床主要用于治療瘀血阻滯證慢性粒細胞白血病［1］。方中三棱有消積止痛、破血行氣作用［2］；紅花有散瘀止痛、活血通經作用，其活血成分為黃酮類成分［3-4］，包括羥基紅花黃色素A、山柰素、6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷和紅花黃色素B 等。目前，質量標準中僅見青黛和山豆根的薄層色譜鑒別。青黛和山豆根主要是發揮清熱解毒、消腫利咽的作用［5］。青黛中的靛玉紅有治療慢性粒細胞白血病作用［6］，且根據中藥質量標志物基于性-效-藥（Q-Marker）的概念［7-8］，中藥質量標志物主要是指能與中藥功能密切相關的成分，可作為反映中藥安全性和有效性的標志性物質進行質量控制。因此，該質量標準的控制與中藥質量標志物的概念關系不緊密，具有一定缺陷。本研究中對處方中青黛采用薄層色譜（TLC）法進行鑒別，采用超高效液相色譜（UPLC）法測定慢粒靈顆粒（膠囊）中羥基紅花黃色素A、6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷和紅花黃色素B，對其紅花藥材進行質量控制，可為提高和完善慢粒靈顆粒（膠囊）的質量標準提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Water ACQUITY H-Class 型超高效液相色譜儀，包括Empower 3 工作站（美國沃特世儀器公司）；Sartorius BT124 型電子天平（北京賽多利斯儀器公司，精度為萬分之一）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；Mili-Q 型超純水機（美國密理博公司）。

1.2 試藥

慢粒靈顆粒（醫院制劑室自制，批號分別為20190320，20190706，20180516，規格為每袋15 g）；慢粒靈膠囊（ 醫院制劑室自制，批號分別為20190704，20190730，20190801，規格為每粒0.45 g）；羥基紅花黃色素A 對照品（批號為111637-201308，含量為96.5%），靛藍對照品（批號為110716-201612），靛玉紅對照品（批號為110717-201805），購自中國食品藥品檢定研究院；6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷對照品（批號為MUST-19041506，含量99.72%），紅花黃色素B 對照品（批號為MUST-19041507，含量99.68%），均購自成都曼斯特公司；乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；三氯甲烷、丙酮、甲苯、三氟乙酸、磷酸二氫銨、磷酸，均為分析純，均購自上海國藥集團化學試劑公司；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 青黛TLC 鑒別

取3 批慢粒靈顆粒各1 袋，研細，稱取粉末各10 g；取膠囊20 粒，研細，分別置具塞錐形瓶中，加三氯甲烷20 mL，超聲處理（功率為350 W，頻率為50 kHz）10 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取靛藍、靛玉紅對照品，加氯仿制成每1 mL 各含0.5 mg 的溶液，作為對照品溶液。再取缺青黛的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。照2015 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取上述4 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-丙酮（5 ∶4 ∶1，V/ V/ V）為展開劑，展開，取出，晾干，置日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色 譜 柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-0.01%三氟乙酸水溶液（B），梯度洗脫，0～5.5 min 時2%A～5%A，5.5～8.4 min 時5%A～9%A，8.4～19.8 min 時，9%A～20%A，19.8～22 min 時20%A；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：380 nm；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取羥基紅花黃色素A 對照品12.52 mg、6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷10.08 mg 和紅花黃色素B 9.96 mg，精密稱定，置同一25 mL 容量瓶中，加25%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。取慢粒靈顆粒（批號為20190320）10 袋，研細；取慢粒靈膠囊20 粒，研細。精密稱取上述粉末各1.0 g 置150 mL 具塞錐形瓶中，分別加25% 甲醇50 mL，超聲處理（功率為350 W，頻率為50 kHz）30 min，取出，放冷，加25%甲醇補足減失的質量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取慢粒靈顆粒處方量的1 /10，制備缺紅花藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備紅花陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取上述3 種溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。詳見圖2。可見，紅花陰性樣品對3 種成分的測定無干擾。

線性關系考察：取上述對照品貯備溶液作為5 號對照品溶液，分別精密吸取50，100，1 000，2 000 μL，分別置10 mL 容量瓶中，依次作為1～4 號對照品溶液。分別取上述1～5 號對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進樣測定，以進樣量（X，ng）為橫坐標、相對應峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表1。

精密度試驗：分別精密收取線性關系考察項下的1號、3 號和5 號對照品溶液，按擬訂色譜條件連續進樣6 次。結果1 號對照品溶液中羥基紅花黃色素A、6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷、紅花黃色素B 峰面積的RSD 分別為1.98%，2.03%，1.65%（n=6）；3 號對照品溶液中羥基紅花黃色素A、6-羥基山柰酚-3-O-β-葡萄糖苷、紅花黃色素B 峰面積的RSD 分別為1.37%，1.55%，1.12%（n=6）；5 號對照品中羥基紅花黃色素A、6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷、紅花黃 色 素B 峰 面 積 的 RSD 分 別 為0.62% ，1.05% ，0.88%（n=6）。結果表明，儀器精密度良好。

圖2 慢粒靈顆粒中3 種黃酮類成分高效液相色譜圖

表1 3 種成分線性關系考察結果（ n=3）

穩定性試驗：取上述供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，12，24 h 時按擬訂色譜條件進樣測定，連續考察24 h，記錄色譜峰面積。結果羥基紅花黃色素A、6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷和紅花黃色素B 峰面積的RSD 分別為1.98%，2.32%，2.56%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

重復性試驗：取慢粒靈顆粒（批號為20190320），依法制備供試品溶液6 份，按擬訂色譜條件分別進樣測定。結果羥基紅花黃色素A、6-羥基山柰酚-3- Oβ-葡萄糖苷和紅花黃色素B 的平均含量分別為6.08，0.66，2.16mg/g，RSD 分別為2.01%，1.52%，1.36%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取羥基紅花黃色素A 28.62 mg、6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷9.73 mg，精密稱定，置同一10 mL 容量瓶中，加25%甲醇溶解稀釋至刻度，作為待加溶液1；取紅花黃色素B 8.28 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加25%甲醇溶解并稀釋至刻度，作為待加溶液2；取已知含量的慢粒靈顆粒6 份，精密稱定，每份0.5 g，置具塞錐形瓶中，向上述6 份樣品中分別加入上述待加溶液1 和待加溶液2 各1 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，并計算回收率。結果見表2。

2.2.4 樣品含量測定

取3 批慢粒靈顆粒/膠囊，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，結果見表3。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）

表3 慢粒靈顆粒/膠囊中3 種黃酮類成分含量測定結果（mg/g）

3 討論

3.1 指標成分選擇

預試驗中，首先采用TLC 法對方中君藥莪術和三棱進行薄層鑒別，結果發現二者相同成分較多，陰性成分互相有干擾，通過調整展開劑比例和不同的供試品制備方法均未能排除干擾，因此未將君藥列入本研究。方中青黛的主要成分靛玉紅具有消炎、抗腫瘤等藥理活性，故選擇TLC 法進行鑒別控制；紅花有活血化瘀、消炎、抗腫瘤的功效，其中以黃酮類成分羥基紅花黃色A、6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷和紅花黃色素B 含量較高，因此，選擇上述3 種成分為指標成分進行含量測定。

3.2 供試品溶液制備方法選擇

首先考察不同提取溶劑（水、25%甲醇、75%甲醇和甲醇）的影響，結果發現甲醇作為提取溶劑時，羥基紅花黃色A 和紅花黃色素B 的含量下降較大；純水作為溶劑時，色譜峰雜質較多，6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷峰形拖尾；25%甲醇作為提取溶劑時，3 種成分的含量相對較大，且峰形良好，分離度大于1.5。因此，選擇25%甲醇作為提取溶劑。采用三因素三水平（制備方法為回流、超聲、索氏提取；超聲時間為20，30，40 min；超聲功率為150，300，450 W）進行優化時，發現3 種提取方法提取率相差不大，超聲功率對其也無明顯影響，但隨著超聲時間的延長，含量逐漸增大，30 min 與40 min 含量接近。因此，確定供試品制備方法為25%甲醇超聲（功率為300 W，頻率為50 kHz），提取30 min。

3.3 測定條件選擇

采用PDA 檢測器對3 種成分進行全波長掃描，結果發現于380 nm 波長處3 種成分的干擾較小，峰形對稱，分離效果好，故選擇380 nm 作為3 種成分含量測定的最佳波長。由于黃酮類化合物易溶于甲醇、乙腈，因此流動相的選擇先后采用甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.5%乙酸溶液等多種流動相進行洗脫，結果發現，當乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相時，各色譜峰分離較好，峰形對稱。故選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

3.4 方法評價

本研究中建立的TLC 法專屬性強，無干擾；UPLC法可同時測定紅花中羥基紅花黃色A、6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷和紅花黃色素B 3 種黃酮類成分的含量，且具有分析速度快、準確性高、重復性好的優點，可用于慢粒靈顆粒中青黛和紅花藥材的質量控制，同時為提高慢粒靈顆粒（膠囊）的質量標準提供參考。