黑曲霉生長最低水分活度研究*

周志云，楊 靜，李 翠，胡 科，楊曉莉△

（1. 陜西省食品藥品監督檢驗研究院，陜西 西安 710061； 2. 陜西盛德泰林生物安全技術檢測有限公司，陜西 西安 710061）

水分含量是反映藥品質量安全和穩定的一個重要參數［1-4］。水分活度（Aw）是指食品或藥品等物質在密閉容器中達到平衡狀態時的水分蒸氣壓與該溫度下純水的飽和蒸氣壓的比值［4-5］。微生物的生長必須有水，但結合在分子內的水不能被微生物利用，只有游離的水才能被利用［6］，故采用水分活度來表示能被微生物利用的實際含水量，控制水分活度可抑制微生物的生長。各類不同的微生物與水分活度的關系主要體現在臨界點上，低于此臨界點，微生物不能生長［7］。通過不同的介質優化產品處方，設計和控制藥品的水分活度，可降低微生物增殖的風險。《美國藥典》首次收載水分活度測定應用于非無菌制劑微生物控制的章節［8］，將其成功引入制藥工業藥品微生物控制，但目前《中國藥典》對相關內容收載較少。黑曲霉為曲霉屬真菌中的一個常見種屬，廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產品和土壤中，其生長適溫為28 ℃左右，最低相對濕度為88%，能引起水分較高的糧食霉變和其他工業器材霉變。黑曲霉可運用在藥物發酵中，如在甘草發酵過程中可提高甘草甜素的提取率，但若生產不當，則會產生致癌性的黃曲霉毒素［9-10］。本研究中應用氯化鈉、甘油、葡萄糖3 種不同介質調節玫瑰紅鈉瓊脂的水分活度值，以降低黑曲霉可利用的“游離水”程度，從而達到使黑曲霉不再繁殖、生長停滯的目的，并探討黑曲霉生長所需的最低水活度值。現報道如下。

1 儀器、菌種與試藥

1.1 儀器

Aqualab Series 4 型水分活度儀（美國Decagon 公司）；HFsafe-1200 LC 型生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；BS2202S 型電子分析天平（德國賽多利斯公司，精度為0.01 g）；IPP260 型霉菌培養箱（德國Memmer 公司）。

1.2 菌種

黑曲霉Aspergillus niger 標準菌株購自中國醫學細菌保藏管理中心，試驗用菌株為第3 代。

1.3 試藥

沙氏葡萄糖瓊脂培養基（北京陸橋技術有限責任公司，批號為170316）；玫瑰紅鈉瓊脂培養基（北京陸橋技術有限責任公司，批號為181124）；甘油（批號為20180730），氯化鈉（批號為20170308），D（ + ）-無水葡萄糖（批號為20180109），聚山梨酯80（批號為20180821），均由國藥集團化學試劑有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 菌液制備

將黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）上，25 ℃培養7 d，加入5 mL 含0.05%聚山梨酯80 的無菌0.9% 氯化鈉溶液，洗脫孢子，收集孢子懸液，用含0.05%聚山梨酯80 的無菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液，移至無菌試管內，用無菌0.9%氯化鈉溶液制備成每1 mL 含黑曲霉104cfu 的孢子懸液。

2.1.2 培養基制備

玫瑰紅鈉平皿制備：分別稱取氯化鈉、甘油、D（ +）-無水葡萄糖，調節玫瑰紅鈉培養基的水分活度至TL（0.76），T（0.77），TH（0.78），即黑曲霉生長的水分活度限值為0.77，用不同介質調節玫瑰紅鈉培養基，使滅菌后的培養基的水分活度至最低水分活度附近3 個水平（即低于水分活度限值0.01 單位、水分活度限值、高于水分活度限值0.01 單位），同時配制不調節水分活度的玫瑰紅鈉培養基T0。

不同環境水分活度制備：稱取氯化鈉、甘油、無水葡萄糖，置純化水中，調節各溶液水分活度至0.76，0.77，0.78，與玫瑰紅鈉瓊脂平皿水分活度相同。將121 ℃滅菌15 min 后的氯化鈉、甘油、無水葡萄糖溶液置密封干燥器中，制備不同環境水分活度儲存環境。

2.1.3 水分活度測定

預培養：無菌操作將濾膜正面朝上，貼于未調節水分活度滅菌后的玫瑰紅鈉瓊脂平板上。將制備好的菌液用接種針點植于濾膜中心位置，25 ℃預培養48 h。

觀察、轉移與分組：待菌落生長至直徑為5～10 mm時，分別測量濾膜垂直的2 個直徑，取平均值，2 次測量差值不超過2 mm，記為初始大小。在生物安全柜內將菌落連同濾膜小心轉移至制備好的不同梯度水分活度的玫瑰紅鈉瓊脂平板上。TL（0.76），T（0.77），TH（0.78）為試驗組；T0為對照組（0.95～0.97）。

培養：將滅菌后含有不同水分活度的鹽、甘油、無水葡萄糖溶液倒入干燥器內，將玫瑰紅鈉平皿置含有相同水分活度鹽、甘油、無水葡萄糖溶液的密閉干燥器內，置25 ℃培養、觀察。采取水分活度儀-露點/冷面鏡法直接測定調節水分活度［11］，于0，3，7，11，15，19，23，27，31 d 時分別測量并記錄菌落大小。每個驗證試驗分別進行3 次。

2.2 結果

2.2.1 氯化鈉培養介質

以氯化鈉為介質，考察周期為31 d，記錄黑曲霉在0.76，0.77，0.78 水分活度下菌落的生長情況。結果未調節水分活度的玫瑰紅鈉瓊脂平板（對照組）的黑曲霉生長不受環境影響，第3 天超出測量范圍；其余3 組玫瑰紅鈉瓊脂平板均調節水分活度，已接種黑曲霉的濾膜轉移至平板，前3 d，菌落處于適應階段，有不同程度的增長，3 d 后，菌落逐漸趨于平穩。水分活度低于0.77時，3 組黑曲霉菌絲均未出現增長情況。當水分活度調節至0.78 時，第1 次實驗觀察至第23 天，黑曲霉菌絲直徑增長0.5 mm；第2 次實驗觀察至第31 天，黑曲霉菌絲直徑未增長；第3 次實驗觀察至第27 天，黑曲霉菌絲直徑增長了1 mm。詳見圖1 A。因此，以氯化鈉調節水分活度來控制黑曲霉的增長有顯著效果，水分活度控制在0.77 以下時，黑曲霉的增長處于停滯狀態。

2.2.2 甘油培養介質

以甘油為介質，考察周期為31 d，記錄黑曲霉在0.76，0.77，0.78 不同水分活度下菌落的生長情況。結果，未調節水分活度的玫瑰紅鈉瓊脂平板（對照組）的黑曲霉生長不受環境影響，第3 天超出測量范圍；其余3 組玫瑰紅鈉瓊脂平板均調節水分活度，已接種黑曲霉的濾膜轉移至平板，前3 d，菌落處于適應階段，有不同程度的增長，3 d 后，菌落逐漸趨于平穩。水分活度低于0.77 時，3 組黑曲霉菌絲均未出現增長情況。當水分活度為0.78 時，第1 次實驗觀察至第15 天，黑曲霉菌絲呈現增長趨勢，至第29 天，菌絲直徑增長了1.5 mm；第2 次實驗觀察至第25 天，黑曲霉菌絲呈增長趨勢，至第31 天菌絲直徑增長了1.0 mm；第3 次實驗觀察至第29 天，黑曲霉菌絲呈現增長趨勢，至第31 天菌絲直徑增長了1.5 mm。詳見圖1 B。因此，以甘油調節水分活度來控制黑曲霉的增長，水分活度控制在0.77 以下時，黑曲霉的增長處于停滯狀態；水分活度在0.78 時，菌絲雖有增長，但變化不大，直徑只有1～1.5 mm 的增長。

2.2.3 D（ + ）-無水葡萄糖培養介質

以D（ + ）-無水葡萄糖為介質，考察周期為31 d，記錄黑曲霉在0.76，0.77，0.78 不同水分活度下菌落的生長情況。結果，未調節水分活度的玫瑰紅鈉瓊脂平板（對照組）的黑曲霉生長不受環境影響，第3 天超出測量范圍，其余3 組玫瑰紅鈉瓊脂平板均調節水分活度，已接種黑曲霉的濾膜轉移至平板，前3 d，菌落處于適應階段，有不同程度的增長，3 d 后，菌落逐漸趨于平穩。水分活度低于0.76 時，3 組黑曲霉菌絲均未出現增長情況。當水分活度調節至0.77 時，第1 次實驗觀察至第23 天，黑曲霉菌絲呈現增長趨勢，至第31 天菌絲直徑增長了8mm；第2 次實驗觀察至第13 天，黑曲霉菌絲呈增長趨勢，至第31 天菌絲直徑增長了1.5 mm；第3 次實驗觀察至第19 天，黑曲霉菌絲呈現增長趨勢，至第31 天菌絲直徑增長了1 mm。當水分活度調節至0.78 時，第1 次實驗觀察至第7 天，黑曲霉菌絲呈現增長趨勢，至第31 天菌絲直徑增長了13mm；第2 次實驗觀察至第17 天時黑曲霉菌絲呈現增長趨勢，至第31 天菌絲直徑增長了3 mm；第3 次實驗觀察至第9 天，黑曲霉菌絲呈現增長趨勢，至第31 天菌絲直徑增長了1 mm。詳見圖1 C。因此，以D（ + ）-無水葡萄糖調節水分活度來控制黑曲霉的增長，水分活度控制在0.76 以下時，黑曲霉的增長處于停滯狀態；水分活度在0.77 以上時，菌絲呈增長趨勢。

圖1 不同培養介質下3 種水分活度黑曲霉生長情況（ n=3）

3 討論

以氯化鈉為介質調節水分活度為0.76～0.78 時，黑曲霉菌落直徑均無明顯變化。以甘油為介質調節水分活度為0.76～0.77 時，菌落直徑無明顯變化；水分活度為0.78 時，菌落直徑增長1～2 mm。D（ + ）-無水葡萄糖為介質調節水分活度為0.76 時，菌落直徑無明顯變化；水分活度為0.77～0.78 時，黑曲霉菌落直徑增長3～10 mm。不同介質條件下，黑曲霉最低水分活度存在差異，其中氯化鈉調節下的黑曲霉菌落增長不明顯，但通過甘油及葡萄糖調節后，水分活度在0.78 時即出現增長趨勢。可見，通過氯化鈉調節能獲得最低的黑曲霉生長水分活度值。

黑曲霉菌絲測定采用的培養基為SDA，使用D（ +）-無水葡萄糖調節SDA 水活度平板不凝，分析原因可能是SDA 培養基處方中含有大量的葡萄糖［12］。但在配制水分活度為0.76 的SDA 平板時，需在原處方基礎上添加較大量的葡萄糖，這改變了培養基的特性，導致試驗無法繼續。經過各種試驗研究后選用玫瑰紅鈉瓊脂培養基，解決了水分活度較低的情況下平板不凝的問題。

在藥品生產領域，尤其是中藥材、中藥飲片、中藥顆粒經常在運輸及貯存過程中發生霉變［13］。因此，在非無菌藥品的配方開發和保質期研究中引入水分活度的概念十分有必要［14-15］，通過不同的介質優化產品處方，設計和控制藥品的水分活度，降低微生物增殖的風險是發展趨勢。本研究結果顯示，當水分活度不超過0.76 時，黑曲霉菌落生長處于停滯期，這與文獻［8］的研究結果基本一致。