肝內膽管癌細胞X 染色體耦聯鋅指蛋白的表達及復方苦參注射液的調控作用

宋昌興，李 新，馬春蘭，張常虹，安貴忠

（1. 青海省第五人民醫院，青海 西寧 810007； 2. 青海省政務服務監督管理局，青海 西寧 810007）

肝內膽管癌（ICC）是原發性肝癌中的第二高發惡性腫瘤，發病率僅次于肝細胞肝癌的肝臟原發惡性腫瘤，在東南亞地區較常見［1-2］。其確切病因尚不明確，常見誘因有寄生蟲侵入、酒精刺激、肝病惡化、膽管炎等［3］。X 染色體耦聯鋅指蛋白（ZFX）對人體細胞的生長、繁殖、更新可產生作用，能使人遠離各種疾病帶來的困擾［4］。復方苦參注射液是一種抗癌藥物，由純中藥搭配調和制成，方中苦參對腫瘤細胞有抑制作用。本研究中探討了復方苦參注射液能否通過調控ZFX 的MAPKs 通路來抑制肝內膽管癌細胞的生長?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料[1]

組織蠟塊：收集2015 年7 月至2017 年7 月于醫院肝膽外科進行手術治療且病情資料完整的120 例ICC患者的組織蠟塊，其中鄰近癌旁組織的正常膽管組織80 例，肝內膽管結石標本40 例。納入研究患者全身無擴散轉移且未經任何放射治療，其中男89 例，女31 例；年齡38～65 歲，平均（43.23±9.5）歲；淋巴轉移22 例，無淋巴轉移98 例。排除血清癌胚抗原較低患者。所有患者對該研究均知情，自愿無償參加。

試藥：ZFX 蛋白抗體（美國Abgent 公司，批號為A-AI10955）；GAPDH 抗體（批號為3777-100），PARP抗體（批號為3002-100），均購自美國Bio Vision 公司；p-JNK 抗體（武漢益普生物科技有限公司，批號為CY42771）；p-p38 抗體（美國Santa Cruz 公司，批號為SC-7973）；DAB 顯色試劑盒（上海如吉生物科技有限公司，批號為SJH1047）；TRIZOL 試劑盒（北京天漠科技開發有限公司，批號為TM180208）；CCK-8 試劑（上海滬震實業有限公司，批號為HZ2771）；Transwell 小室（北京優尼康生物科技有限公司，批號為353090）；慢病毒（上海漢恒生物科技有限公司，批號為TL-738）。

1.2 方法

蛋白質印跡（WB）法檢測ZFX 及MAPKs 通路蛋白：將ICC 組織放入新EP 管中，加入裂解液，混勻。待裂解完成后，離心操作30 min。去上清液，放入EP 管中，冰上保存待用。用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，相關步驟按說明書進行。完成后與上樣緩沖液混合、離心、低溫保存。根據實驗要求的數量配膠。在冰箱中取出SDS-PAGE，按說明配制需要的質量濃度溶液，配制好后放入電泳液中，4 ℃保存。電泳后，用無水乙醇活化PVDF 膜，活化后放入超純水中。用轉模儀轉模，電壓為25 V，電流為0.8 mA。配制p-JNK，p-p38，p-ERK 一抗溶液。孵育后洗膜，用TBST 溶液清洗30 min。洗完后孵育二抗，完成后同樣用TBST 溶液清洗，方法同上。洗膜后，拍照，顯影后分析。

慢病毒shRNA 介導對ZFX 的干擾實驗：在6 孔板中接種ICC 細胞，當細胞的密度升至50%時進行慢病毒感染，MOI 值為20（若需加快轉染速率，可接入適量ploybrene 試劑）；細胞成對生長后用嘌呤霉素進行篩選；癌組織細胞放入1.5 mL 離心管中，加入buffer 混勻。靜置5 min，加入氯仿震蕩，離心，用吸附柱提取總RNA，然后放入逆轉錄儀器中，按說明書設定程序；逆轉錄操作結束后，取cDNA 進行PCR 擴增ZFX 和β-catin，置-20 ℃冰箱中保存；將實驗中的細胞和熒光試劑放在冰上解凍，解凍后加入相應試劑震蕩混合，然后放入熒光定量儀中按設定程序進行熒光定量?；虮磉_水平操作按試劑盒說明書進行，ICC 腫瘤細胞接種在6 孔板中，在低血清環境中培養（培養基12 h 后需進行更換）。培養結束后，采用多聚甲醛固定、結晶紫染色，通過光學顯微鏡下觀察細胞的顏色、大小，拍照后對細胞進行計數。

CCK-8 細胞增殖實驗［3］：用0.5%胰酶消化處于對數生長期的細胞5min，離心操作3min，轉速為800r/min。每個96 孔板放入大約5 000 個細胞，每孔加入100 μL 培養基，讓細胞在培養液中迅速繁殖。當繁殖密度為40%時，更換培養液，在37 ℃及5% CO2中繼續培養，到待測時間點時，加入CCK-8 試劑，每空加入約10 μL。培養1 h，測定吸光度值，波長為450 nm。

免疫組化染色法檢測ICC 細胞中ZFX 蛋白分布：免疫組化染色采用DAB 顯色，操作步驟按試劑盒說明書嚴格進行。

Transwell 法檢測ICC 細胞遷移能力：用培養基稀釋實驗所需的Matrigel 膠，待濃度下降至原來的1/5 時，用滴管取40 μL 放入Transwell 中，在37 ℃環境下等待約1 h 孵育完成。用干細胞培養液調整濃度后置37 ℃及5%CO2中孵育24 h。計算ICC 細胞的數量和占比。

2 結果

2.1 ZFX 蛋白在ICC 癌組織中的表達

與癌旁組織中的正常肝細胞相比，癌組織中的mRNA含量較高。與癌旁組織中ZFX 蛋白表達水平相比，癌組織中的明顯更高。癌旁組織在染色后，出現陽性區域。ICC 組織染色情況顯示，75%癌組織存在高表達狀態，而癌旁組織中ZFX 蛋白高低表達無明顯差異。詳見圖1。

2.2 抑制ZFX 表達對肝內膽管癌細胞生長能力的影響

shRNA 的導入顯著抑制了ZFX 蛋白的表達；正常培養條件下，ZFX 蛋白的干擾不會影響LM3 和RBE 細胞的生長；在無糖環境下，干擾細胞和對照細胞的增殖能力減弱；在低血清濃度和干擾ZFX 細胞的條件下，膽管癌細胞增殖和存活能力受到抑制。詳見圖2。

2.3 復方苦參注射液對ZFX 的調控作用

采用腫瘤壞死因子α（TNF-α）聯合放線菌酮（CHX）刺激對照細胞和干擾ZFX 的膽管癌細胞進行探討。單用TNF-α 處理細胞，細胞無形態改變；但經TNF-α+CHX 處理3 h 后，細胞形態產生變化，處理6 h后對照細胞凋亡，而ZFX 干擾組細胞凋亡數量很少。聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶（PARP）水平的檢測是在經TNF-α+CHX 處理的細胞裂解液中進行。由圖3 可見，對照細胞中PARP 比shZFX 蛋白細胞高，且差異顯著。檢測MAPKs 信號通路中關鍵蛋白p-JNK，p-p38，p-ERK 的磷酸化。結果顯示，p-JNK，p-p38，p-ERK 在干擾細胞中的磷酸化水平高于對照細胞，表明ZFX 蛋白在MAPKs 通路中調節細胞存活能力。其中，感受氧化應激的p38 的活化最明顯，表明復方苦參注射液可調控ZFX 在MAPKs 通路中的表達來抑制細胞的存活能力。

圖1 ZFX 蛋白在ICC 癌組織中的表達［6］

圖2 抑制ZFX 蛋白表達對膽管癌細胞在不同培養環境中生長能力的影響

圖3 ZFX 蛋白調節細胞存活可能通過影響MAPKs 信號通路

3 討論

鋅指蛋白基因家族是人類基因家族中不可缺少的一員［5］，主要由X 染色體編碼而成。ZFX 屬鋅指蛋白家族，與ZFT 及ZFA 為同一家族，其在結構上非常相似［6］。ZFX 內部含有多個C2H2結構，使其結構擁有細胞轉錄激活區、核定位序列和DNA 結合點［7］，具有保守性。ZFX 通過與鋅離子結合成“手指”狀，使基因在細胞、人類胚胎發育、造血干細胞自我更新中有重要作用［8-9］。ZFX 在參與干細胞自我更新的同時，可將癌細胞變大變多，加速其增殖和轉移，促進癌癥惡化，導致患者病情惡化，影響預后［10-11］。但通過下調細胞MAPKs通路使ZFX 基因表達受阻，使ICC 細胞無法在體內外增殖［12-14］。

復方苦參注射液可通過促進淋巴細胞的免疫功能來抑制和殺死腫瘤細胞。現代研究發現，苦參堿可通過影響端粒酶作用［15-16］來發揮上述功能，尤其對T 細胞作用極明顯［17］。ICC 在早期無明顯癥狀，患者發現并確診為該病時已錯過最佳治療時期［18-19］。由于淋巴組織細胞轉移和擴散速度快，常規治療和手術對其無決定性作用，因此大部分患者經手術治療的預后效果不佳［20］。

本研究結果顯示，在ICC 癌組織中ZFX 表達水平很高，癌旁組織中也有表達，但明顯低于癌組織。干擾ZFX 的細胞在低血清環境下擁有較高的繁殖能力；在低糖環境下，ZFX 蛋白生長狀況較差，表明糖是ICC 細胞生長的必備條件。平板克隆實驗顯示，ZFX 可抑制細胞凋亡，表明ZFX 蛋白對細胞凋亡有調節作用。信號通路MAPKs 研究結果顯示，在ZFX 蛋白干擾情況下，p38 在感受氧化應激條件下蛋白活性異常增強，提示干擾ZFX 蛋白細胞在不良環境下更有存活優勢。

本研究中，將ICC 細胞置低糖含量、低血濃度的培養環境下，以探討ZFX 蛋白的功能。雖然實驗條件仍有不足，但對下一步的研究有較大參考意義。本研究中探討了抑制ZFX 的表達對ICC 細胞的影響，但并未研究增加ZFX 后的效果，可在今后的研究中繼續觀察。

綜上所述，ZFX 在ICC 中處于高表達狀態，復方苦參注射液通過對ZFX 在MAPKs 信號通路中的控制，可有效抑制ICC 細胞的生長。ZFX 可能是ICC 的潛在新型生物治療靶點。