高糖對人角膜上皮細胞創傷修復中Cyclin D1 蛋白表達的影響

趙楠楠， 陳梨萍, 修 皓, 鄭振優, 唐 平, 籍雪穎

0引言

糖尿病性角膜病變(diabetic keratopathy, DK)臨床常見于持續性角膜上皮缺損、角膜潰瘍、內眼術后角膜上皮再生延遲等[1]，嚴重影響視力，甚至致盲。角膜上皮病變和創傷延遲修復的機制，以及其與糖尿病的關系，是眼科當前學術研究熱點。高血糖狀態下，機體代謝異常導致細胞結構功能受損。細胞周期素蛋白(Cyclin)與細胞分化、增殖密切相關。角膜上皮細胞受損后其修復過程需要細胞進行細胞分裂，需要由細胞分裂的間期進入到分裂期，在細胞周期進程中，Cyclin D1是G1期細胞周期素，其主要調控節點是G1/S期，Cyclin D1能夠激活細胞周期蛋白依賴性激酶，從而使細胞由G1期進入到S期，促進細胞有絲分裂的進行[2]，故Cyclin D1在角膜上皮細胞修復過程中起著調節細胞增殖能力的作用，對角膜上皮修復快慢及成功與否起著至關重要的作用。Cyclin D1是Wnt信號通路β-catenin下游靶基因，調控細胞增殖、分化和遷移。有研究證實核糖核酸酶5可上調Cyclin D1蛋白通過啟動細胞周期進程，促進角膜內皮損傷愈合[3]。在此基礎上我們推測DK與角膜上皮細胞Cyclin D1的表達存在一定的關系。研究證實，與正常組(葡萄糖濃度為5.5mmol/L)相比，當葡萄糖濃度高于25mmol/L時，隨著葡萄糖濃度的增加，人角膜上皮細胞的增殖活性降低，并且呈時間和濃度依賴性[4]。張穎[5]的研究同樣顯示，葡萄糖濃度為25mmol/L時最適合制作人角膜上皮細胞高糖模型，故本實驗選取25mmol/L為高糖作用濃度，旨在探討高糖環境下，觀察不同時間點人角膜上皮細胞的形態和功能修復的差異，以及人角膜上皮細胞創傷修復過程中細胞周期素Cyclin D1 蛋白基因表達的意義，以期為進一步防控糖尿病性角膜上皮創傷愈合延遲提供新的實驗理論依據。

1材料和方法

1.1材料人角膜上皮細胞：北納創聯生物技術有限公司；貨號：BNCC337876，高糖DMEM：Hyclone；貨號：SH30022.01，FBS：Gibco；貨號：10099141，雙抗：Hyclone；貨號：SV30010，胰蛋白酶0.25%, Trypsin-EDTA (1×)溶液：Gibco；貨號：25200056, DMSO：Sigma；貨號：D2650，抗Cyclin D1抗體(兔抗)：Abcam；貨號：ab134175，二抗山羊抗兔：Abcam；貨號：ab6721，抗β-actin抗體(鼠抗)：Abcam；貨號：ab4990，二抗山羊抗鼠：Abcam；貨號：ab6785，ECL顯色液：Millipore；貨號：WBKLS0100，熒光染料SYBR Green Mix (2×)：Thermo：K0221，蛋白maker：Fermentas：貨號：26617。

1.2方法

1.2.1細胞處理和總RNA及總蛋白提取細胞復蘇后，用完全培養基(高糖DMEM+10%FBS)重懸，放置在37℃，5%二氧化碳培養箱中培養，當細胞貼壁生長至80%以上后，進行傳代：將對數生長期的細胞消化制成單細胞懸液，以1×104/孔接種于培養板，37℃，0.5%CO2細胞培養箱內培養。細胞傳代1～2代后，按上述傳代方法將細胞傳至直徑為35mm細胞培養皿中，共傳10皿，并分為兩組：高糖處理組和正常對照組，于37℃，0.5%CO2細胞培養箱內培養24h后，將高糖處理組培養基更換為含25mmol/L葡萄糖的DMEM完全培養基，正常對照組則更換為加等體積蒸餾水的DMEM完全培養基。待細胞長滿后，進行劃傷處理，每皿呈“#”字形劃傷處理[6]。分別培養0、12、24、48、72h后提取細胞總RNA和總蛋白，并測定總RNA(Nanodrop 2000測定)及總蛋白濃度(BCA法測定)。

1.2.2 qRT-PCR檢測Cyclin D1 mRNA的表達根據試劑盒說明書提取細胞總RNA，用Transcriptor First-Strand cDNA synthesis kit (Thermo Fisher Scientifci, Waltham, MA, USA)將mRNA逆轉錄成cDNA。采用特異性引物進行qRT-PCR：Cyclin D-F：CTCGGTGTCCTACTTCAAATGT； Cyclin D-R：TCCTCGCACTTCTGTTCCT；β-actin-F：ACCCTGAAGTACCCCATCGAG；β-actin-R：ACATGATCTGGGTCATCTTCTC。qRT-PCR擴增體系為：Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2×) 12.5μL，正反向引物各1μL，cDNA 500 ng，ddH2O補充至25μL。反應程序為：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，40 cycles；熔解曲線。

1.2.3 Western blot檢測Cyclin D1蛋白的表達將提取的各時間點總蛋白進行SDS-PAGE，進行常規Western blot實驗，檢測劃傷條件下高糖處理組和正常對照組不同時間(0、12、24、48和72h)角膜上皮細胞中Cyclin D1蛋白的表達。配制SDS-PAGE凝膠(4%濃縮膠，12%分離膠)，根據不同時間點總蛋白濃度計算各時間點用量(蛋白用量為2μg)，加入對應量的5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴煮沸5～8min，冰浴5min后上樣，80V電泳至蛋白到達分離膠時將電壓改為100V繼續電泳1～2h(根據具體需要進行調整)，電泳結束后將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1～2h，加入兔抗人Cyclin D1一抗，4℃孵育過夜，PBST沖洗3次后加入山羊抗兔二抗，室溫輕微震蕩孵育2h，PBST沖洗3次，黑暗條件下加入ECL反應5～15min，在BioRad化學發光凝膠成像系統曝光1～15min，以β-actin為內參。

在倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞生長狀況及其變化，選取各組細胞不同時間點劃痕處清晰且寬度基本一致、細胞形態明顯處進行觀察拍照。

統計學分析：采用統計學軟件SPSS21.0分析數據，多組之間比較采用重復測量數據的方差分析，各組的時間差異比較，采用LSD-t法進行兩兩比較，各時間點的組間差異比較，采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1角膜上皮細胞細胞形態學觀察利用倒置顯微鏡，對劃傷刺激條件下正常對照組和高糖處理組細胞進行觀察(圖1)。結果顯示：劃傷處理前即處理0h的細胞，細胞沒有顯著差別，細胞呈比較均勻的扁平單層貼壁生長，形態規則，細胞膜光滑，細胞核透亮，整體上高糖處理組的細胞生長較正常對照組緩慢。劃傷處理12h和24h后，劃傷處細胞形態并無多大差別，但與正常對照組相比，高糖組劃傷邊緣處的漂浮細胞明顯要多，細胞重新貼壁情況差，間距增加。隨著處理的時間延長，劃傷處由前面的不平整逐漸趨于平滑，且細胞開始重新向劃傷處外緣生長。劃傷處理48h顯示，高糖處理組的細胞生長速度要比正常對照組慢，劃傷處不如對照組平整，向外伸出的細胞突起較對照組少。劃傷處理72h，兩組劃傷處邊緣的細胞突起明顯增多，細胞密度明顯增大，但是正常對照組細胞狀態明顯要好于高糖處理組，高糖處理組細胞形態有一定改變，明顯變圓，高糖處理組雖然細胞突起增大，但是劃傷邊緣的凹陷仍然較多，對照組則沒有這種情況，這反映高糖組的細胞活性較差。

2.2 qRT-PCR檢測Cyclin D1 mRNA表達水平比較對qRT-PCR數據進行分析結果顯示差異有統計學意義(F時間=350.985，P時間<0.001；F交互=2.893，P交互<0.001；F組間=1906.661，P組間<0.001)；兩組間12、24、72h比較差異均具有統計學意義(均P<0.001)。兩組各組內不同時間點(12,24,48,72h)與各組的0h間Cyclin D1表達量比較差異均有統計學意義(正常對照組：t12h vs 0h=-0.843，P12h vs 0h<0.001；t24h vs 0h=-0.927，P24h vs 0h<0.001；t48h vs 0h=-0.793，P48h vs 0h<0.001；t72h vs 0h=-0.840，P72h vs 0h=<0.001。高糖處理組：t12h vs 0h=-0.687，P12h vs 0h<0.001；t24h vs 0h=-0.483，P24h vs 0h<0.001；t48h vs 0h=-0.773，P48h vs 0h<0.001；t72h vs 0h=-0.710，P72h vs 0h<0.001)，見表1。

表1 各組細胞中不同時間點Cyclin D1 mRNA表達情況

qRT-PCR匯總結果如圖2示：高糖處理組和正常對照組中Cyclin D1的表達均隨著處理時間延長而下調，各時間點的表達量與0h比，均存在顯著差異，其中對照組中最低表達量出現在24h，其表達量僅為0h的0.08倍，處理組中最低表達量出現在48h，其表達量為0h的0.25倍。高糖處理后，與正常對照組相比，Cyclin D1 mRNA表達呈上調趨勢，但隨著高糖處理時間延長，上調作用減弱，且在48h處mRNA水平恢復至與對照組同一水平。

圖2 劃傷條件下，高糖處理組不同時間點Cyclin D1 mRNA的表達 n=3，aP<0.05 vs 正常對照組。

2.3 Western blot檢測Cyclin D1表達Western blot檢測結果顯示見圖3。劃傷刺激能夠上調Cyclin D1的表達，隨著時間的延長上調作用逐漸減弱，無論是正常對照組還是高糖處理組，其最高表達量出現在12h。高糖處理組與正常對照組相比，高糖處理組各時間點的Cyclin D1表達量均低于正常對照組，提示，高糖處理對Cyclin D1的表達存在抑制作用。因此，Western blot 實驗結果顯示，劃傷刺激能夠上調Cyclin D1的表達，且25mmol/L葡萄糖處理能夠減弱劃傷刺激對Cyclin D1的上調作用，高糖能夠抑制Cyclin D1的表達。

圖3 Western blot檢測處理不同時間位點Cyclin D1蛋白表達。

3討論

目前中國成為全球糖尿病患者最多的國家之一，在眼科領域，糖尿病患者角膜創傷延遲愈合的發生率較高[7]，為臨床帶來諸多棘手的病癥，譬如角膜上皮糜爛、大皰性角膜病變、反復的角膜潰瘍甚至致盲，成為眼科學亟待解決的問題。DK的發病機制尚不明確，研究高血糖對DK發展的病理影響，目前主要集中在細胞和分子水平研究。Zhang 等[8]報道外源性netrin-1促進糖尿病小鼠角膜上皮傷口愈合和神經纖維再生，而高糖可阻斷創傷誘導的角膜上皮細胞netrin-1表達上調。2型糖尿病合并角膜點狀上皮病變患者的基底下神經叢及基底上皮細胞減少導致角膜上皮愈合延遲[9]。另外，高糖狀態可以降低細胞間黏附能力，從而造成角膜上皮細胞的損傷[10]。Song 等[11]研究也證實胰島素依賴型糖尿病可以改變角膜的正常節律性，減少角膜上皮有絲分裂,增加角膜炎性因子的表達。以上研究均表明高糖呈負性調節，導致角膜上皮細胞損傷，神經組織受損，修復再生延遲。

參考針對糖尿病角膜上皮細胞病變機制與高糖狀態下人角膜上皮細胞增殖、凋亡模型的文獻研究[4-5]，篩選出最適高糖濃度及處理時間，以高糖下體外培養的人角膜上皮細胞為研究對象，模擬DK的高糖微環境,通過倒置顯微鏡觀察細胞劃傷刺激后的生長情況和形態學變化。結果顯示，高糖培養的人角膜上皮細胞劃傷后，細胞遷移能力受損。與正常對照組相比，高糖處理組遷移入創傷區的細胞數量明顯減少，細胞折光性弱，伸展不良，創傷區愈合率顯著降低，并且隨著處理的時間延長，高糖處理組的人角膜上皮細胞生長速度要比正常對照組慢，細胞突起少且活性較差，細胞分裂現象較正常對照組弱，提示高糖的負性調節作用，與相關文獻研究結果一致。

創傷作為一種刺激，可激活機體下游信號通路，誘導細胞遷移至創傷區，細胞周期蛋白(Cyclin)-細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(Cyclin dependent kinase, CDK)-細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制因子 (Cyclin dependent kinase inhibitor, CKI)系統是細胞增殖的內源性調控系統, 其中,Cyclin D1在細胞周期 G1 期啟動,是Wnt信號通路β-catenin下游靶基因，調控細胞增殖、分化和遷移。Wnt信號通路在眼科學角膜病相關研究中尚處于起步階段，有研究證實人角膜上皮細胞有Cyclin D1 蛋白的表達，且Wnt1蛋白可促進Cyclin D1蛋白基因的表達，且其表達量與Wnt1蛋白量呈正相關[12]。內外環境刺激下，核糖核酸酶5上調Cyclin D1蛋白， D3等通過激活PI3激酶/AktCECs 啟動細胞周期進程，促進角膜內皮損傷愈合[3]。基于此，我們初步推斷Cyclin D1蛋白在調控細胞周期的作用下，促進了角膜相關細胞活化增殖能力，呈正性調節作用，且與某些信號分子有關。在前期研究[12]基礎上，本實驗設置25mmol/L葡萄糖處理組和蒸餾水正常對照組，通過給予角膜上皮細胞劃傷刺激后，qRT-PCR檢測兩組組間差異性和時間點測量值的時間差異性分析，結果具有統計學意義。劃傷刺激后檢測兩組Cyclin D1 mRNA表達水平上調，高糖處理組與正常對照組相比，Cyclin D1 mRNA表達呈上調趨勢，但隨著高糖處理時間延長，上調作用減弱，且在48h處mRNA水平恢復至與對照組同一水平。而Western blot 檢測蛋白表達結果顯示：高糖組在各時間點檢測的Cyclin D1蛋白表達量均低于正常組，提示高糖對Cyclin D1的表達存在抑制作用。基因的表達調控存在轉錄、轉錄后修飾及翻譯等水平的調控，RNA表達量就是轉錄水平調控，而蛋白表達量則收到轉錄后修飾及翻譯水平的調控，本研究中的Cyclin D1的RNA表達和蛋白表達量不一致，說明Cyclin D1在角膜上皮細胞中的表達調控可能存在轉錄后修飾或者翻譯水平的調控。另一方面，本實驗采用模擬高糖環境，與真正的糖尿病患者角膜上皮細胞所處環境有所差異，故不排除這是導致qRT-PCR結果與Western blot結果不一致的原因。劃傷刺激增加Cyclin D1的上調，而高糖環境下，人角膜上皮創傷愈合延遲，并隨時間延長呈進行性損害，Cyclin D1表達受損，從而導致細胞在相應的時相受阻，細胞周期循環不能進行，細胞不能進行有絲分裂，從而誘導人角膜上皮細胞凋亡，這可能是導致角膜上皮細胞創傷愈合延遲的原因之一。另外，也有研究顯示，高糖通過活性氧系統抑制表皮生長因子受體的信號轉導，從而抑制角膜上皮細胞損傷后修復[13]，多種信號通路系統參與調控角膜創傷愈合，這與本實驗結論相一致，但是Cyclin D1是否可以作為藥物相關靶基因，尚需更多研究加以證實。

角膜上皮微環境的動態平衡對維持正常視力和上皮組織的完整性極為重要，人角膜上皮細胞體外培養有助于了解角膜細胞的生物學特性、構建體外疾病模型、構建生物人工角膜[14]以及更好地發揮其臨床作用[15]，譬如利用Rock抑制劑聯合低氧-常氧培養方式構建工程角膜上皮[16]，有助于深入認識角膜上皮病變的病理生理過程，為角膜病的發病機制提供新的思路。本實驗采用25mmol/L葡萄糖濃度培養基，角膜上皮細胞生長環境為高滲狀態，高滲透壓可能影響細胞功能及炎性介質功能。譬如譚秋凡等[17]研究在高滲條件下，炎癥小體各聚合成分和炎癥因子的mRNA水平上調，人角膜上皮細胞中c-Jun氨基末端蛋白激酶對其釋放的具有抑制作用。本實驗未把滲透壓因素作為研究變量，可能對結果有一定影響。但高糖對角膜上皮細胞創傷修復的影響，是否與高滲作用有關，也需要通過后續實驗驗證。細胞周期蛋白在眼表疾病的科研應用國內外鮮有研究報道，且機制較為復雜，我們實驗初步探索下存在不足之處，也缺少針對蛋白的統計與量化，尚待開展更多高質量研究進一步優化，彌補不足。

綜上所述，由于糖尿病導致的疾病流行率、相關醫療費用[18]和視力損害的增加，因此，臨床醫生理應重視并加強對DK的探索。本次實驗初步探討了高糖狀態下角膜上皮細胞增殖與分化的潛在機制，以及細胞周期素Cyclin D1 蛋白基因表達的相關意義，有助于深入了解糖尿病性角膜上皮創傷愈合延遲的分子調控機制，并為DK研究提供新的實驗理論依據。

2師忠芳, 韓明, 徐立新等.體外培養大鼠星形膠質細胞劃傷模型.中國康復理論與實踐 2007；13(12):1132-1133