P21 抑制劑UC2288 誘導鼻咽癌放射抗拒細胞CNE-2R凋亡的研究

梁仁拔李欣曉朱小東

(1.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院,南寧 530021；2.廣西區域高發腫瘤早期防治重點實驗室,南寧 530021；3.廣西醫科大學附屬武鳴醫院,南寧 530021)

鼻咽癌是發生于鼻咽部的惡性上皮腫瘤,常見于我國南方及東南亞地區,尤其在廣東省高發,俗稱“廣東瘤”[1]。 放射治療是鼻咽癌的主要治療手段,大部分早期患者通過放射治療能得到根治。 遺憾的是,臨床上約有20%的鼻咽癌患者經過治療后仍出現局部復發和遠處轉移[2-3],主要歸因于鼻咽癌放射抗拒。 再程放療毒副反應大,而且以鉑類為基礎的化療反應率為40%～65%,預后差[3]。 因此,有必要探索更多的治療策略,為鼻咽癌的治療提供新的選擇。

P21 是周期蛋白依賴性激酶抑制劑,參與DNA損傷反應[4]。 UC2288,分子式為C20H18ClF6N3O2,全稱叫反-1-(4-氯-3-三氟甲基-苯)-3-[4-(5-三氟甲基-吡 啶-2-烷 氧 基)-環 己 基]-脲。 研 究 發 現,UC2288 是P21 的抑制劑,通過轉錄和轉錄后途徑下調P21 的表達[5]。 UC2288 的結構與索拉非尼的結構相似[5]。 作為多種激酶抑制劑,索拉非尼能有效延長晚期肝癌、腎癌患者生存時間[6-7],在復發或者轉移鼻咽癌患者中,也顯示出一定的抗腫瘤作用[8-9]。 然而,與索拉非尼不同的是,UC2288 不抑制RAF 激 酶 或 者 VEGF 活 性[5]。 研 究 發 現,UC2288 對人結腸癌HCT116 細胞有一定的抑制作用[10],但其具體的作用機制及對其他腫瘤的影響尚不清楚,有必要進行更深入全面的研究。

本研究利用鼻咽癌放射抗拒細胞株CNE-2R[11-13],探討UC2288 對CNE-2R 細胞增殖和凋亡的影響及其可能的作用機制,為鼻咽癌的治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

CNE-2R 細胞由廣西醫科大學腫瘤醫院放療科構建。

1.2 主要試劑與儀器

UC2288 購自美國Abcam 公司；RPMI-1640 培養基,胎牛血清購自美國Gibco 公司；青鏈霉素,二甲基亞砜(DMSO)購自中國索萊寶公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化液購自中國碧云天公司；PBS 緩沖液購自中國中杉金橋公司；CCK-8 試劑盒購自日本同仁公司；Annexin V-APC/7-AAD 雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD 公司；Hoechst 33342 染色液中國索萊寶公司；BCA 蛋白定量試劑盒中國碧云天公司；Western blot 所用抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司；增強型化學發光自顯影試劑盒(enhanced chemiluminescence,ECL)購自中國百智生物公司；EVOS FL Auto 熒光顯微鏡購自美國Life technologies 公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

鼻咽癌放射抗拒細胞CNE-2R 用RPMI-1640 完全培養液(含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素)置于37℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養,待細胞貼壁生長至融合度達90%以上時,用胰酶消化傳代。

1.3.2 藥物配制

UC2288 用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)配成5 mmol/L 的母液,置于-20℃冰箱儲存。 臨用時用完全培養液配制成不同濃度的工作液。

1.3.3 CCK-8 實驗

取對數生長期的CNE-2R 細胞,以3500 個/孔、每孔100 μL 接種于96 孔板中培養,設空白組(不含細胞的培養液)、對照組(DMSO 組)及UC2288 處理組(2、4、6、8、12、16 μmol/L),每組5 個平行孔。24 h后,棄原培養液,按以上分組作用細胞24、48 h,每孔加入10 μL CCK-8 試劑,37℃避光孵育1 h 后,用酶標儀測450 nm 處吸光度(OD)值,計算細胞存活率。 存活率(%)= (OD處理組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

1.3.4 平板克隆形成實驗

以300 個細胞/孔接種于6 孔板,置培養箱中培養24 h 后,用不同濃度的藥物(0、2、4、6、8 μmol/L)作用細胞48 h。 更換新培養液繼續培養12 d 后,PBS 緩慢沖洗2 次,4%多聚甲醛固定30 min,姬姆薩染色30 min,晾干后拍照,利用Image J 軟件計算克隆數。

1.3.5 觀察細胞形態

細胞接種于6 孔板,培養24 h 后,用不同濃度的藥物(0(DMSO),4、6、8、12、16 μmol/L)作用細胞48 h。 于倒置顯微鏡觀察細胞數量及形態變化。

1.3.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

堆料裝置行走機構采用自行式驅動系統，對于場地不平的堆場建議采用履帶式行走系統，行走機構在駕駛室通過操縱桿控制，操作自如。

取適量細胞接種于6 孔板中,待細胞貼壁后棄去舊培養基,加入不同濃度的藥物(0、4、6、8、12 μmol/L)。 培養48 h 后,收集上清液,用不含EDTA 的胰蛋白酶消化并收集細胞,根據Annexin V-APC/7-AAD 試劑盒說明書操作,1 h 內上流式機檢測。

1.3.7 Hoechst 33342 染色實驗

取適量細胞接種于6 孔板中,待細胞貼壁后棄去舊培養基,加不同濃度的藥物(0、4、8 μmol/L)。作用24 h 后,用PBS 緩慢沖洗2 次,每孔加入1 mL Hoechst 33342 染色液,37℃避光孵育30 min。 棄染色液,用PBS 洗滌2 次,于熒光顯微鏡觀察細胞核的形態及染色的亮度。

1.3.8 蛋白免疫印跡

將細胞接種于25 cm2培養瓶中,培養至融合度為70%左右時,加不同濃度的藥物(0、4、8 μmol/L)。 處理24 h 后,提取細胞蛋白,以BCA 法測蛋白濃度。 將蛋白樣品等體積上樣于10% SDS-PAGE電泳,冰中恒壓濕轉。 5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。TBST 洗膜,一抗Bcl-2(1 ∶1000)、Bax(1 ∶1000)、Survivin(1 ∶1000)、Cleaved-caspase 3(1 ∶1000)、Caspase 3(1 ∶1000)、γ-H2AX(1 ∶1000)、P21(1 ∶1000)、PARP(1 ∶1000)、GAPDH(1 ∶1000)4℃ 孵育過夜,TBST 洗膜3 次,每次10 min。 HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗(1 ∶1000)室溫孵育1 h。 TBST 洗膜3 次,每次10 min。 ECL 化學發光試劑盒進行曝光顯影。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 UC2288 降低CNE-2R 細胞的活力

UC2288 結構如圖1A 所示。 CCK8 結果顯示,UC2288 明顯抑制CNE-2R 細胞的增殖,呈劑量依賴和時間依賴關系。 與對照組相比,當UC2288 濃度≥4 μmol/L 時,各組間存活率差異具有統計學意義(P＜0.05,圖1B)

2.2 UC2288 抑制CNE-2R 細胞克隆形成

為進一步驗證UC2288 對細胞增殖的影響,進行克隆形成實驗。 結果表明,濃度≥4 μmol/L處理組的克隆形成數目明顯減少(圖2A),與對照組比較,差異具有統計學意義(P＜0.05,圖2B)。 這顯示UC2288 對細胞的長期增殖能力也有明顯的抑制作用。

2.3 顯微鏡下觀察細胞形態的變化

UC2288 處理CNE-2R 細胞48 h 后,直接在顯微鏡下觀察,隨著濃度的增加,細胞圓形萎縮或結構不完整, 體積變小, 脫落增多。 當濃度為16 μmol/L 時,細胞大部分脫落死亡(圖3A)。Hoechst 染色后通過熒光顯微鏡觀察,經藥物處理后,細胞核皺縮,染色亮度增高,呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染(圖3B),表明細胞染色質凝聚濃縮,發生凋亡。

圖1 UC2288 對CNE-2R 細胞活力的影響Note.A, Structure of UC2288.B, Cell viability.Compared with control group, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 1 The effects of UC2288 on cell viability of CNE-2R

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

鑒于UC2288 抑制細胞的增殖,且形態學觀察發現細胞在藥物的作用下發生死亡,本研究運用流式細胞術進一步檢測UC2288 對細胞凋亡的影響。Annexin V-APC/7-AAD 雙染實驗表明,隨著UC2288濃度的增高,細胞凋亡率顯著增加(圖4A),各處理組間差異具有統計學差異(P＜0.05,圖4B)。

圖2 UC2288 對CNE-2R 細胞克隆形成能力的影響Note.Compared with control group, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 2 The Effects of UC2288 on clone formation ability of CNE-2R

圖3 UC2288 對CNE-2R 細胞形態的影響Note.A, Cell morphology under light microscope.B, Hoechst 33342 staining.Figure 3 The effects of UC2288 on cell morphology of CNE-2R

2.5 UC2288 對凋亡相關蛋白的影響

蛋白免疫印跡結果顯示,與對照組相比,隨著UC2288 濃度的提高,促凋亡蛋白Bax、Cleavedcaspase 3、Caspase 3 表達增高,而抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin 表達下降。 DNA 雙鏈斷裂標志蛋白 γ-H2AX 表達升高,預示DNA 發生斷裂損傷。 結果表明,UC2288 可能通過誘導DNA 雙鏈斷裂,引起細胞凋亡(圖5)。

2.6 UC2288 對PARP 蛋白的影響

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]是DNA 修復酶。 如圖6 所示,UC2288 作用細胞后,PARP 表達水平明顯降低。 這表明,UC2288 可能通過抑制PARP 表達,誘導DNA損傷。

圖4 UC2288 對CNE-2R 細胞凋亡的影響Note.Compared with control group, *P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 4 The effects of UC2288 on cell apoptosis of CNE-2R

圖5 UC2288 對CNE-2R 細胞凋亡相關蛋白表達的影響Note.Compared with control group, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 5 The effects of UC2288 on expression of apoptosis-related proteins in CNE-2R

圖6 UC2288 對CNE-2R 細胞PARP 蛋白表達的影響Note.Compared with control group, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 6 The effects of UC2288 on expression of PARP in CNE-2R

3 討論

鼻咽癌好發于東南亞地區。 每年新發病大約87000 例,70%患者是局部晚期[14]。 局部晚期鼻咽癌的標準治療方案是放化療。 經過治療后,仍有10%患者出現殘留或局部復發[15-16]。 再程放療和手術可挽救局部治療失敗。 然而,再程放療風險大,約33%患者發生5 級毒副反應[17]。 鼻咽位置較深,結構復雜,挽救性手術難度大,且40%以上的患者出現面部麻木、牙關緊閉、腭瘺等并發癥[18]。 對于遠處轉移患者,采用以順鉑為基礎的姑息化療,反應率為40%～65%。 因此,需探索更多的治療策略,為提高鼻咽癌療效提供更多的選擇。

本研究發現,UC2288 明顯抑制CNE-2R 細胞的增殖,呈濃度-效應和時間-效應關系；Hoechst 33342 染色實驗和流式細胞術結果提示UC2288 誘導CNE-2R 細胞凋亡,隨著濃度的增加,凋亡率顯著升高,且Western blot 中促凋亡蛋白Bax、Cleavedcaspase 3、Caspase 3 表達增高和抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin 表達下降,更加驗證UC2288 的促凋亡作用。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶在DNA 單鏈斷裂(single strand breaks,SSBs)修復中發揮重要的作用,主要通過堿基切除修復(base excision repair,BER)途徑[19]。 PARP 被激活時,招募其他DNA 修復蛋白,參與DNA 損傷修復[20]。 抑制PARP 活性,可阻止DNA 單鏈斷裂的修復,產生雙鏈斷裂,最終導致細胞死亡[21-22]。 因此,PARP 抑制劑已運用于臨床,在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌治療中取得良好的療效[23]。 有研究發現,P21 調節PARP活性,參與DNA 損傷修復[24]。 敲除P21,引起PARP 活化,減少DNA 損傷[25]。 本研究中,UC2288作用CNE-2R 細胞后,γ-H2AX 表達增加,PARP 表達下降,而P21 表達不呈劑量依賴性變化,這提示UC2288 可能不是通過P21 途徑調控PARP,UC2288可能通過直接抑制PARP 的活性,從而引起DNA 雙鏈斷裂。 然而,這需要進一步實驗的探索。

綜上,本研究表明UC2288 可顯著抑制CNE-2R細胞的增殖,誘導細胞凋亡,這可能與降低PARP 活性,引起DNA 雙鏈斷裂有關。 這為UC2288 進一步的研究提供理論基礎,有可能為鼻咽癌的綜合治療提供更多的選擇。