海馬和前腦皮層BDNF 和VEGF 表達與慢性應激所致小鼠抑郁的相關性

孫孟軍董澤飛*王 宏

(1.邢臺醫學高等專科學校,河北 邢臺 054000；2.華北理工大學附屬醫院精神科,河北唐山 063000)

抑郁癥是情感性精神障礙的一種臨床表現,主要表現為顯著而持久的情緒低落、思維遲緩等,嚴重者甚至會出現自殺的念頭或行為[1]。 近年來抑郁癥的發病率正不斷提高,但其發病機制較為復雜,尚未明確,一般認為其可能與遺傳因素、神經介質及環境等有關[2]。 有研究發現,抑郁癥的發生、發展與腦內神經營養因子及神經可塑性改變等因素關系密切。 神經營養因子對促進突觸生長、維持神經元生存具有重要作用[3]。 據國外相關研究報道,海馬與前腦皮層相關神經營養因子的表達與抑郁的發生密切相關[4]。 若海馬、前腦皮層等腦區缺少神經營養因子,相應的腦功能會受到抑制,最終導致抑郁癥的發生[5]。 腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是由Zhang等[6]首先在豬腦中發現的一種具有神經營養作用的蛋白質。 有研究發現,心理學、物理學應激、長期注射皮質酮或束縛應激的大鼠海馬BDNF 水平明顯降低,同時大鼠出現抑郁樣行為。 BDNF 水平與抑郁癥嚴重程度關系密切[7]。 血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種高度特異性的促血管內皮生長因子,能夠使血管通透性增加,刺激血管再生,保護缺血及退變的神經元,促進大腦神經元的再生。 Turner 等[8]研究發現在抑郁癥患者發作期,VEGF 水平明顯升高。 抑郁癥的發病機制較為復雜,單一理論或是單一因子治病方面已有多方面研究,但從幾個方面聯合研究致抑郁的較少。 本組研究采用不同的應激因子建立小鼠應激抑郁模型,從BDNF 及VEGF 兩種因子的角度出發,旨在探討海馬和前腦皮層BDNF 和VEGF 表達與慢性應激所致的小鼠抑郁的相關性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級 KM 小鼠 58 只,2 月齡,雌雄小鼠各 29只,體重18～19 g,購自上海睿太莫斯生物科技有限公司[SCXK(滬)2016-0011],無菌手術在上海睿太莫斯生物科技有限公司屏障動物實驗設施[SYXK(滬)2017-0033]進行,經本校倫理委員會審批通過(IACUC-2018-008)。 于本實驗室溫度(22±5)℃,濕度(57±8)%,光暗交替各12 h 的環境下飼養,自由攝食、飲水。 實驗過程中堅持3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業股份有限公司,生產批號:20166626,規格:100 mL)；VEGF 抗體(武漢默沙克生物科技有限公司)；BDNF 抗體(上海賽默飛世爾科技有限公司)；戊巴比妥鈉(上海新亞藥業有限公司,生產批號:31160240,規格:25 g)。電子秤(山東暢歐商貿有限公司, 型號: HZA50001)；曠場行為檢測箱(使用不透明材料制成底面為75 cm×75 cm 的正方形,將其等位成25 個等邊方格,底面為白色,周圍為黑色,在距箱頂50 cm 處放一60 W 燈光)；秒表(深圳市鑫宏茂科技發展有限公司,型號:HS-70 W)；冰箱(山東博科科學儀器有限公司,型號:BYC-250)；小鼠避暗箱(上海軟隆科技發展有限公司,規格:BW-YLS-17B)；morris 水迷宮(江上海欣軟信息科科技有限公司,型號:XRXM101-Z)；石蠟切片機(上海聚慕醫療器械有限公司,型號:HM3555)；恒溫水浴箱(上海赫田科學儀器有限公司,型號:HH-US)。

1.3 實驗方法

建立抑郁癥小鼠模型:將小鼠隨機分為對照組與觀察組兩組,觀察組小鼠采用禁食(24 h 內不提供飼料,正常飲水)、禁飲(24 h 內不提供飲水,正常提供飼料)、電擊足底(采用小鼠避暗箱進行操作:35 V 電壓,每次 1 min,每次 6 s,共 20 次)、高臺(將小鼠置于高150 cm,寬2.5 cm 的高臺上60 min)、冰水游泳(使用自制的高16 cm 的水桶中,內有5℃冷水,水深14 cm,將小鼠放入其中,5 min 后取出)等多種應激因子刺激,每天隨機選擇一種,共20 d。對照組小鼠不接受實驗應激原,以同樣條件飼養。

應激前、應激后10 d、20 d 均測定小鼠體重。

Morris 水迷宮實驗:將水迷宮分為四個區域,在每個區域內進行入水點標記設置,將一隱蔽的圓形平臺放于第四區域。 在定向航行實驗中(每天3次,共3 d),每次隨機選取一個區域入水,在90 s 內找到圓形平臺的時間為逃避潛伏期。 觀察并記錄小鼠找到并爬上平臺所需時間。 第4 天時將平臺撤去進行空間探索實驗,從原區域入水,記錄小鼠在90 s 內找到原平臺區域的探索時間,若在90 s 內未找到平臺,則需將小鼠引到平臺。 48 h 后重復實驗,觀察小鼠的逃避潛伏期、游泳路程及在各象限停留時間變化。

曠場實驗:于應激第20 天進行曠場實驗,將小鼠放入曠場行為實驗箱中,觀察小鼠在10 min 內的行為表現,每只小鼠實驗結束后徹底清洗實驗箱,觀察兩組小鼠的洗臉、舔足等修飾次數、排便粒數、中央區停留時間以及垂直運動得分。

海馬及前腦皮層 BDNF 及 VEGF 表達:采用Motic Images Advanced 3.3 系統對海馬及前腦皮層BDNF 及VEGF 免疫組化陽性神經元結果進行分析,計算其平均光密度值。 采用免疫組化法觀察慢性應激后小鼠海馬及前腦皮層BDNF 及VEGF 的表達情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件包進行統計學數據分析,計量資料兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。 統計所得結果以P＜0.05 為有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠體重變化比較

結果顯示,兩組小鼠體重均呈上升趨勢,但對照組小鼠體重增加明顯優于觀察組。 應激前,兩組小鼠體重水平相差不大(P＞0.05),應激后,觀察組小鼠體重明顯低于對照組(P＜0.01),見表1。

2.2 morris 水迷宮實驗結果比較

觀察組小鼠逃避潛伏期、游泳路程及在第二象限的停留時間明顯高于對照組(P＜0.05 或P＜0.01),而兩組在其他象限的停留時間無明顯差異(P＞0.05),見表 2。

表1 兩組小鼠體重變化比較(,n=29)Table 1 Comparison of body weight changes between two groups of mice

表1 兩組小鼠體重變化比較(,n=29)Table 1 Comparison of body weight changes between two groups of mice

分組Groups應激前Before stress應激后10 d Post-stress 10 d應激后20 d Post-stress 20 d觀察組 Observation group 25.49±0.46 25.72±0.55 26.71±0.61對照組 Control group 25.79±0.74 34.56±1.08 40.76±1.65 t 值t value -1.854 -39.279 -43.010 P 值 P value 0.069 ＜0.001 ＜0.001

表2 Morris 水迷宮實驗結果比較(,n=29)Table 2 Comparison of morris water maze test results

表2 Morris 水迷宮實驗結果比較(,n=29)Table 2 Comparison of morris water maze test results

Quadrant dwell time(s)訓練周期1 訓練周期2 訓練周期1 訓練周期2 第一象限 第二象限 第三象限Training cycle 1 Training cycle 2 Training cycle 1 Training cycle 2 First quadrant Beta quadrant Third quadrant觀察組bservation group 59.26±5.26 35.54±2.46 824.21±217.49 692.75±119.17 24.21±1.61 34.58±1.94 31.49±1.15分組Groups逃避潛伏期(s) 游泳路程(cm) 象限停留時間Escape latency Swimming distance對照組Control group 37.14±2.67 22.36±1.59 671.52±165.42 493.16±98.82 23.75±1.17 43.93±2.75 30.58±2.17 t 值t value 20.194 24.231 3.009 6.943 1.245 -14.961 1.995 P 值P value ＜0.001 ＜0.001 0.004 ＜0.001 0.218 ＜0.001 0.051 O

2.3 曠場實驗結果比較

觀察組小鼠修飾次數、垂直運動得分明顯低于對照組,中央區停留時間明顯高于對照組(P＜0.01),兩組小鼠排便粒數無明顯差異(P＞0.05),見表3。

2.4 海馬和前腦皮層BDNF 和VEGF 表達情況

與對照組相比,觀察組海馬CA1 區及前腦皮層BDNF、VEGF 表達水平明顯降低(P＜0.05),而兩組CA3 區 BDNF 比較差異無統計學意義(P＞0.05)。 見表4,圖1。 顯微鏡下觀察發現,對照組小鼠細胞核完整,細胞質成條狀或聚集分布,觀察組小鼠神經元細胞核固縮、碎裂,細胞明顯變圓。 見圖2,圖3。

表3 曠場實驗結果比較(,n=29)Table 3 Comparison of open-field experimental results

表3 曠場實驗結果比較(,n=29)Table 3 Comparison of open-field experimental results

分組Groups修飾次數Number of modifications排便粒數Number of defecation granules中央區停留時間Central residence time垂直運動得分Vertical motion score觀察組Observation group 1.45±0.31 2.34±0.52 15.59±2.57 15.03±3.45對照組Control group 2.41±0.28 2.39±0.91 7.36±1.49 32.02±3.44 t 值t value -12.376 -0.257 14.919 -18.779 P 值P value ＜0.001 0.798 ＜0.001 ＜0.001

表4 海馬和前腦皮層BDNF 和VEGF 表達(,n=29)Table 4 Expression of BDNF and VEGF in hippocampus and forebrain cortex

表4 海馬和前腦皮層BDNF 和VEGF 表達(,n=29)Table 4 Expression of BDNF and VEGF in hippocampus and forebrain cortex

分組Groups BDNF VEGF海馬CA1 Hippocampal CA1海馬CA3 Hippocampal CA3前腦皮層Frontal cortex海馬CA1 Hippocampal CA1海馬CA3 Hippocampal CA3前腦皮層Frontal cortex觀察組Observation group 0.14±0.02 0.12±0.03 0.16±0.02 0.12±0.02 0.13±0.01 0.15±0.02對照組Control group 0.18±0.03 0.14±0.05 0.21±0.05 0.14±0.02 0.14±0.02 0.17±0.04 t 值t value 5.974 1.847 5.000 3.808 2.408 2.408 P 值P value ＜0.001 0.070 ＜0.001 ＜0.001 0.019 0.019

圖1 海馬和前腦皮層BDNF 和VEGF 表達情況Note.A, Expression of BDNF in hippocampus and forebrain cortex.B, Expression of VEGF in hippocampus and forebrain cortex.Figure 1 Expression of BDNF and VEGF in hippocampus and forebrain cortex

圖2 BDNF 在海馬和前腦皮層的表達情況Note.A, Expression of BDNF in the hippocampal CA1 region of the observation group mice.B, Expression of BDNF in the hippocampal CA2 region of the observation group mice.C,Expression of BDNF in the forebrain cortex of the observation group mice.D,Expression of BDNF in the hippocampal CA1 region of the control group mice.E, Expression of BDNF in the hippocampal CA2 region of the control group mice.F, Expression of BDNF in the forebrain.Figure 2 BDNF expression in hippocampus and forebrain cortex

圖3 VEGF 在海馬和前腦皮層的表達情況Note.G, Expression of vascular endothelial growth factor in the hippocampal CA1 region of the observation group mice.H, Expression of vascular endothelial growth factor in the hippocampal CA2 region of the observation group mice.I, Expression of vascular endothelial growth factor in the forebrain cortex of the observation group mice.J,Expression of vascular endothelial growth factor in the hippocampal CA1 region of the control group mice.K, Expression of vascular endothelial growth factor in the hippocampal CA2.L, Expression of vascular endothelial growth factor in the forebrain cortex of the control group mice.Figure 3 Expression of vascular endothelial growth factor in hippocampus and forebrain cortex

3 討論

抑郁癥是一種情緒障礙性精神病,其主要特點是情緒低落、思維遲鈍、語言運動減少、自責自責、得失受挫,甚至有自殺傾向,嚴重影響了人們的身心健康及生活質量。 隨著社會的發展,社會競爭更加激烈,人們的精神壓力倍增,抑郁癥的發病幾率大大增加,現逐漸得到人們的廣泛關注。 據報道,強烈應激或長期處于應激狀態會對人們的健康產生嚴重影響[9]。 經多項研究表明,電擊足底、高臺、禁食、孤獨等多種應激原均可引起動物腦內神經遞質、神經激素等的改變,導致動物行為及學習記憶功能的損害[10]。 本組實驗以小鼠為研究對象,采用多種應激原刺激建立慢性刺激隨之的小鼠抑郁模型,觀察海馬和前腦皮層BDNF 和VEGF 的表達情況,并分析海馬和前腦皮層BDNF 和VEGF 表達與慢性應激所致小鼠抑郁的相關性。

海馬中含有多種信使受體,特別是皮質類固醇、興奮性氨基酸和血清素受體,它們是對應激最敏感的區域。 有研究發現,慢性應激會對海馬結構產生嚴重影響,使海馬結構產生器質性改變,可能與腎上腺素分泌的糖皮質激素對海馬的直接作用有關[11]。 本組研究中,觀察組小鼠中央區停留時間、逃避潛伏期、游泳路程及在第二象限的停留時間明顯高于對照組,修飾次數、垂直運動得分明顯低于對照組(P＜0.05 或P＜0.01)。 提示慢性應激能夠導致學習記憶的損傷,降低小鼠的興奮性、適應性以及對環境的警覺性。 這可能與慢性應激會使小鼠出現腦體積縮小,海馬容量降低等腦內改變有關。 海馬區是空間記憶形成和保持的部位,空間學習記憶能力可以作為反應抑郁的重要指標[12]。

近年來,神經營養因子與抑郁癥的關系備受人們關注,BDNF 表達水平與抑郁癥的發生關系密切。BDNF 是神經營養因子家族的一員,主要表達于中樞神經系統,包括大腦皮層、下丘腦、海馬等,是腦內分布最廣泛的神經營養因子[13]。 本組研究中,觀察組海馬CA1 區、CA3 區及前腦皮層BDNF 表達水平明顯低于對照組(P＜0.05),提示BDNF 可能參與了慢性應激對小鼠海馬及前腦皮層的損傷。 BDNF 是一種小分子多肽物質,能夠維持神經元功能、促進神經元再生、修復以及預防神經元退行性疾病,而慢性應激會明顯減少海馬神經元的數量,降低BDNF 表達水平。 與Sobreviela 等[14]研究結果相同。

VEGF 一種高度保守的同源二聚體糖蛋白,能夠直接作用于血管內皮細胞,促進血管內皮細胞的增殖,提高血管通透性。 Glat 等[15]認為血管系統是構成海馬神經元再生的重要微環境,VEGF 發生可能對抑郁癥的發生具有一定影響。 本組研究結果中,觀察組海馬CA1 區、CA3 區及前腦皮層VEGF表達水平明顯低于對照組(P＜0.05)。 提示VEGF具有抗抑郁樣作用,VEGF 表達下降能夠導致抑郁癥的發生。 這可能與慢性應激能夠明顯抑制血管內皮細胞增殖,抑制海馬齒狀回顆粒細胞層下區的神經祖細胞表達神經元和膠質細胞有關[16]。

綜上所述,慢性應激會導致小鼠出現體重減輕、學習記憶損傷、環境警覺性降低等抑郁樣行為,慢性應激后,小鼠海馬及前腦皮層BDNF 和VEGF表達水平明顯降低,其表達與慢性應激所致小鼠的抑郁具有一定相關性。