新型冠狀病毒肺炎診斷的相關實驗室檢測技術應用

杜晶輝， 李 莎， 劉 旭

（天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193）

2019 年12月發現于我國武漢的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）目前已成全球蔓延趨勢，在COVID-19的診治中，實驗室檢測起到了至關重要作用。在這一新發傳染病的救治過程中，各醫療機構結合診治實踐，總結出COVID-19的重要實驗室檢驗指標，并編制了臨床路徑[1-2]，包括確診、鑒別診斷和輔助診斷3部分。目前，關于鑒別診斷檢測技術的研究相對較少，確定診斷檢測技術中病毒核酸檢測是重要手段，血清抗體檢測也可作為確診指標。輔助診斷檢測技術主要是在疾病治療中發揮作用。我們對COVID-19的確定診斷、鑒別診斷和輔助診斷相關實驗室檢測技術進行概述。

1 COVID-19確定診斷實驗室檢測技術

1.1 病原學診斷

病原學診斷主要包括病毒的分離培養和核酸檢測。病毒分離培養是實驗室診斷病毒的“金標準”，但是由于該方法檢測時間長（體外分離培養需要6 d）、生物安全等級要求高（P4實驗室），因此在臨床上的開展受到限制[3]。嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）核酸檢測方法較多，包括逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）、等溫核酸擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術、依賴核酸序列擴增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）技術、環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術、基于成簇的規律間隔的短回文重復序列/及其相關蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein，CRISPR/Cas）基因核酸檢測技術、基因芯片技術、基因測序等。其中，實時熒光RT-PCR及基因測序為相關部門推薦的檢測方法[4]。

1.1.1 實時熒光RT-PCR SARS-CoV-2的基因組為單鏈正RNA，需先通過反轉錄酶合成互補的cDNA鏈，再以cDNA鏈為基礎進行PCR擴增[5]。截至2020年4月27日，我國國家藥品監督管理局（the National Medical Products Administration，NMPA）共批準了19個SARS-CoV-2核酸檢測試劑（表1）。熒光RT-PCR主要分為二重實時熒光RT-PCR和三重實時熒光RT-PCR（均為Taqman探針法）。二重檢測的靶基因主要是RdRp基因[位于開放讀碼框1a/b（open reading frame 1ab，ORF1ab）、核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）]；三重檢測的靶基因是RdRp基因、N基因和包膜蛋白（envelope protein，E）基因。有研究團隊已經對6種不同品牌的試劑盒進行了比較，得出了部分試劑的準確性、靈敏度及重復性欠佳的結論[6]。

表1 NMPA批準的SARS-CoV-2核酸檢測試劑（截至2020年4月27日）

實時熒光RT-PCR檢測核酸的方法具有靈敏度高、特異性強、相對基因測序速度快、可批量化和成本低的優點，但相對血清抗體檢測，其對實驗場所及人員要求高、操作繁瑣、耗時長，檢測人員感染風險高，結果受樣本質量、實驗條件及人員操作等因素影響較大[7]，特別是假陰性問題，使核酸檢測的作用一度被質疑。假陰性結果主要由樣本質量、樣本采集時間與病毒含量、樣本的保存、運輸和處理及試劑盒本身的局限性、檢驗操作等因素導致，已有許多研究針對這些因素提出了對策：（1）樣本質量。下呼吸道樣本（深部痰、肺泡灌洗液或支氣管灌洗液等）較上呼吸道樣本（鼻咽拭子）更易檢出病毒，但COVID-19患者一般為干咳無痰，灌洗液樣本采集難度大、危險系數高；采集下呼吸道樣本一般可在插管的患者中進行，上呼吸道樣本建議采集鼻拭子，或同時采集鼻拭子和咽拭子，放入同一個采集管中，采集拭子宜采用植絨拭子[8-9]。（2）樣本采集時間與病毒含量。隨著病程的進展，不同部位的病毒含量是不同的，因此不同病程應采用不同方法采集不同部位的樣本[10]。（3）樣本的保存、運輸和處理。RNA病毒核酸穩定性較差，樣本采集后應該盡快進行檢測，24 h內檢測可置于4 ℃保存，無法24 h內檢測，應-70 ℃或以下保存。樣本的運輸應在4 ℃進行，運輸容器應有病毒保存液[11]。（4）試劑盒本身的局限性。應急研發生產的試劑盒缺少完整的臨床應用和方法學驗證，實驗室在使用不同批號試劑前應做相應的性能驗證[6]。選擇至少包含最為保守及特異的ORF1ab區域以及N基因的試劑盒[12]。（5）檢驗操作。磁珠法是較為常用的核酸提取方法，具有簡便、高效、提取濃度及純度較高等優點[11]，實驗室應參加室間質評并做好室內質控，指派專業人員進行檢測。針對核酸檢測的假陰性問題，大多學者建議以血清抗體檢測作為SARS-CoV-2核酸檢測陰性疑似病例的補充檢測，或在疑似病例確診時與核酸檢測協同應用[13]。結 果判讀應結合各品牌試劑說明書（表2）。

表2 SARS-CoV-2的實時熒光PT-PCR檢測結果判讀

1.1.2 基因測序 基因測序可對樣本中未知基因組序列進行全新測定和鑒定，以確認未知病原體基因組信息。我國學者利用二代測序的宏基因組學技術，于2020年1月7日從患者體內分離出SARS-CoV-2并進行了基因組測序，并于2020年1月12日向世界衛生組織上報了相關信息?；驕y序技術可用于未知感染性疾病宏基因組學分析和傳染病監控，快速應對新型傳染性疾病的暴發，提高對疾病發生和傳播的理解，并進行數據共享，指導核酸檢測產品的設計等[14]。還可幫助了解病毒的遺傳信息，對病毒進行追蹤和溯源，為臨床診斷及治療提供科學依據，并為病原學、免疫學和流行病學研究奠定基礎[15]。

基因測序技術的高敏感性、高準確性特點較適用于最初病毒的鑒定和后期病毒的進一步研究，以及對疑難病例的診斷與鑒別診斷[16]，但由于對實驗室環境、設備和人員素質的要求較高（專業人員對序列的解讀），且耗時長、成本高，不適合用于SARS-CoV-2的快速、大批量的常規檢測[17]。

1.2 血清抗體檢測

人體感染SARS-CoV-2后，病毒會作為抗原刺激人體免疫細胞產生抗體，因此可以通過檢測人體內是否產生特異性的抗體來間接判斷是否感染SARS-CoV-2。檢測的抗體主要分為IgM和IgG 2類。IgM抗體是機體初次免疫應答產生的抗體，產生速度快，但濃度低、維持時間短、親和力差，主要提示現階段被感染的狀態，可作為早期感染的指標；IgG抗體在感染晚期出現，濃度高、維持時間長、親和力好，可提示既往感染。SARS-CoV-2進入人體后到產生IgM抗體約為1周時間，但目前暫無針對COVID-19的抗體檢測窗口期及2次檢測間隔時間的研究，因此何時進行第1次和第2次血清抗體檢測，目前尚無共識。

抗體檢測的樣本主要是血清、血漿或全血，檢測技術主要分為3類：化學發光法、膠體金免疫層析法和酶聯免疫吸附試驗。截至2020年4月27日，NMPA共批準11個SARS-CoV-2抗體檢測試劑，其中膠體金法6個，化學發光法5個。目前，對COVID-19血清抗體檢測的研究主要集中在膠體金免疫層析法，但是相關文件中提出需要進行IgG抗體4倍升高的檢測[4]，我們認為只使用定性的膠體免疫層析法是不能完全滿足要求的。

化學發光法靈敏度高、特異性強、檢測范圍寬，操作自動化高，檢測速度快，但容易檢測出低值的抗體量，假陽性偏高，且需要化學發光儀，成本較高。使用化學發光法測定IgM和IgG臨床特異度可以高達96.20%和92.41%[18]?；瘜W發光法測定總抗體優于膠體金免疫層析法，化學發光法檢測IgM適用于疾病的各個階段[19]。膠體金免疫層析法檢測樣本采集易標準化（全血樣本）、操作簡單、報告時間快（約15 min）[13]，適用于快速篩查，特異性較高，無需特殊設備（目視判定結果），有輔助診斷的價值[20]，然而其檢測靈敏度和準確度相對化學發光法和酶聯免疫吸附試驗低，容易出現假陰性結果，建議與其他方法聯用。酶聯免疫吸附試驗具有特異性強、靈敏度高（較膠體金免疫層析法）的特點，載體標準化難度較低，成本相對化學發光法低，但檢測速度慢（1～2 h）、易污染、步驟較為繁瑣，檢測通量相對較小[21]，截至3月16日，尚無NMPA批準的試劑。ZHANG等[22]采用酶聯免疫吸附試驗試劑盒檢測IgG和IgM，連續監測15例COVID-19患者IgG和IgM的滴度變化，發現采樣第5天，IgG的陽性率（81%～100%）和IgM的陽性率（50%～81%）都大幅增加，這與核酸檢測相對較低的陽性檢出率（50%）相反。由于酶聯免疫吸附試驗的性能介于化學發光法和膠體金免疫層析法之間，但檢測時間較長，在COVID-19診斷中未見優勢，故相關研究較少。

核酸檢測聯合抗體檢測結果判讀見表3。

表3 SARS-CoV-2核酸檢測聯合血清抗體檢測結果判讀

抗體檢測操作簡單，對實驗環境及人員要求較低，且僅需采集血液標本（相對核酸樣本采集風險較低）。有研究結果表明，56 ℃ 30 min滅活處理血液樣本對免疫層析法及化學發光免疫分析法（熒光免疫層析法除外）檢測SARS-CoV-2抗體結果幾乎無影響，因此可在檢測前先進行滅活以降低檢驗人員感染風險[23]，可用于COVID-19的早期診斷、流行病學篩查和臨床轉歸預測，是快速篩查和核酸輔助診斷的重要方法[13]。但樣本溶血或紅細胞、纖維蛋白未離心去除、細菌污染、患者自身抗體、嗜異性抗體引起假性非特異性反應會造成假陽性結果[24]。采用防腐劑、抗凝劑等處理樣本，樣本在冰箱中保存過久，試劑使用前未平衡至室溫，用量不足，溫育時間或溫度不足，受到污染或失效（酶聯免疫吸附試驗），層析過快（膠體金免疫層析法）等，都會導致假陽性結果。單獨使用SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體在早期診斷與篩查COVID-19時存在較大的漏診和一定的誤診風險，同時檢測IgM、IgG抗體可以提高檢測的準確性，減少漏診[25]。有研究結果表明，血清學檢測SARS-CoV-2陽性率比較高，將核酸檢測和血清學檢測結果綜合分析，可能提高檢出率[26]。

2 COVID-19鑒別診斷相關實驗室檢測技術

SARS-CoV-2感染所致COVID-19的臨床特征與普通病毒性肺炎相似，需要與其他病原體引起的社區獲得性肺炎進行鑒別診斷[27]，進行呼吸道病原體檢測是將COVID-19與其他呼吸道病毒（流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒等）及肺炎支原體、肺炎衣原體、肺炎鏈球菌等引起的肺炎進行區分的必要措施。當患者在非疫區，且無明顯流行病學接觸史時，應酌情篩查上述病原體，排除這些病原體引起的肺炎，從而做到疾病的早期鑒別診斷[28]。

由于COVID-19疑似患者首先于發熱門診就診，為更好地做到早發現、早隔離，在檢測項目的選擇上應該首先考慮膠體金技術、微流控芯片技術等快速、集成化、高通量的檢測技術[29-30]。四川大學華西醫院實驗室推薦檢測甲/乙型流感病毒抗原篩查、13種常見呼吸道病毒核酸檢測、肺炎支原體抗體、肺炎衣原體抗體和呼吸道樣本細菌培養等[2]。首都醫科大學附屬北京天壇醫院張國軍團隊對出現流感樣癥狀且經胸部影像學檢查證實存在下呼吸道感染的發熱門診就診患者進行膠體金甲/乙型流感病毒抗原抗體檢測，從而快速與SARS-CoV-2感染患者進行鑒別診斷[31]。針對社區獲得性肺炎常見的肺炎鏈球菌檢測，有學者建議使用肺炎鏈球菌尿抗原檢測的方法實現快速檢測[32]。

在結果判讀時，呼吸道病原體檢測全部為陰性，臨床表現具有病毒性肺炎特征，即使SARS-CoV-2核酸檢測陰性，也應重新取陽性率更高的樣本進行核酸檢測，或結合血清學抗體檢測進一步判讀結果。對COVID-19確診患者也應酌情增加呼吸道病原體檢測，根據是否合并其他病原感染[17]來調整治療方案。

3 輔助診斷相關實驗診斷技術

輔助診斷相關的實驗診斷技術包括血液炎性指標（血常規、C反應蛋白、降鈣素原和血清淀粉樣蛋白A等）、生化指標（肝功能、腎功能、心功能、血氣分析等）、免疫指標（促炎細胞因子、趨化因子及淋巴細胞亞群）等。血液炎性指標可用于COVID-19的初步鑒別診斷，張國軍團隊確證了幾類血常規標志物的鑒別屬性，可以作為核酸檢測的一個有效補充。但是SARS-CoV-2引起的感染較為復雜，單純依靠血液炎性指標進行鑒別診斷較困難[31]。生化指標檢測技術主要是通過器官功能檢測判斷和機體損傷情況，進而調整治療方案，SARS-CoV-2與器官損傷具有一定相關性，對肝功能、腎功能等器官功能進行檢測，可有效判斷病情變化。但對患者進行肝、腎、心功能檢測并不能判斷SARS-CoV-2直接損傷組織器官的嚴重程度，應考慮治療藥物是否對這些組織器官造成了損傷。由于SARS-CoV-2主要侵害肺組織，因此血氣分析對于COVID-19肺功能的監測尤為重要，可作為判斷病情的標準之一[33]。針對COVID-19患者免疫反應進行監測，對促炎細胞因子、趨化因子等進行檢測可為臨床免疫干預提供更加準確的切入點，從而充分控制免疫失衡，更好地發揮人體免疫功能。已經有學者分析了中藥在遏制COVID-19引起的免疫過激、細胞因子風暴及抗急性肺損傷中的潛在應用價值[34]。總而言之，輔助診斷相關檢測技術可以為COVID-19的嚴重程度判斷、治療方案調整、預后情況判斷、危險因素分析提供幫助，在疾病的診治中，主要是在“治”中發揮重要作用。

4 總結

COVID-19需要與常見的社區獲得性肺炎進行鑒別診斷，針對這些社區獲得性肺炎病原體的檢測方法已經較為成熟，包括核酸、抗原抗體等檢測技術。采取何種檢測方法，除考慮其本身的性能外，還需要考慮鑒別診斷的檢測速度與生物安全。我們認為，由于COVID-19具有潛伏期長、可無癥狀傳播等特點，對其進行鑒別診斷有更高的要求，因此在發熱門診中除采用快速、準確的檢測方法，如多聯檢測的膠體金方法外，更需要充分結合流行病史、臨床表現、影像學表現等綜合考慮。

COVID-19確定診斷中，核酸檢測具有多種優勢，但是其主要問題是易受采樣、運輸、試劑質量及檢測技術等因素的影響出現假陰性結果。有學者認為呼吸道樣本檢出率為肺組織＞支氣管肺泡灌洗液＞抽吸痰或鼻咽吸取物＞鼻咽拭子或口咽拭子＞鼻拭子[35]，但我們認為樣本取材部位應該結合患者臨床情況及病程進行分析，如患者臨床表現為明顯的病毒血癥，建議采集乙二胺四乙酸抗凝全血進行核酸檢測，如病程尚在感染前期，尚未發展到病毒性肺炎，肺泡灌洗液樣本的檢出率未必高于鼻咽拭子，或者同步采集鼻咽拭子，以提高檢測的陽性率。由于SARS-CoV-2核酸檢測試劑為應急審批，性能驗證可能尚不完善，應對比多家試劑，并進行性能驗證，各地臨床檢驗中心應組織開展SARSCoV-2核酸檢測的實驗室間比對。COVID-19的治療還處于探索階段，各種抗病毒藥物（如抗人類免疫缺陷病毒藥物）的使用，對核酸檢測結果可能也有影響。

血清抗體檢測技術具有快速、簡便、操作性強等優點，對于其抗原抗體交叉反應等引起的假陽性問題，可在結果判讀時結合患者臨床表現盡量避免，COVID-19血清抗體檢測主要的問題應該是窗口期的假陰性問題，即何時進行血清抗體檢測，何時進行第2次檢測，判斷4倍升高是亟需解決的問題，其IgM抗體、IgG抗體產生時間是否與其他病毒類似，目前也尚無有效方法加以判斷。

COVID-19明確診斷后，需要根據疾病嚴重程度選擇不同的治療方案，在疾病的治療過程中需要對組織臟器進行功能監測，從而不斷調整治療方案，治療過程中需要對疾病的風險因素進行評估，對患者預后進行判斷。整個治療過程中都需要輔助診斷檢測技術給予幫助。

綜上所述，不同的實驗室檢測技術各有利弊，在COVID-19診斷中應該聯合使用，取長補短，同時應該綜合考慮患者的流行病學特征、病程、病史、用藥情況、臨床表現、影像學表現等，早發現、早治療。