環形RNA在腫瘤增殖與轉移中的作用

侯艷艷， 范基農， 劉湘帆， 倪培華

（1.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院檢驗系，上海 200025；2.上海市臨床檢驗中心，上海 200126）

環形RNA（circular RNA，circRNA）是一種新型的非編碼RNA，是由前體RNA的5'端和3'端共價閉合形成的環狀結構，其多數定位于細胞質，且序列高度保守，不易被核酸酶降解，在體內非常穩定，并具有組織或發育階段特異性。高度豐富并進化保守的circRNA已被發現在心血管疾病、神經系統疾病、感染和癌癥中發揮重要作用。我們主要討論circRNA在腫瘤發生與發展中的作用，包括腫瘤的增殖和轉移，并進一步展望circRNA對腫瘤的篩查、診斷、預后評估以及靶向治療的可能性。

1 circRNA的形成、生物特征、作用機制與檢測方法

circRNA在真核細胞中分布廣泛，且具有許多顯著特性和重要生物學功能，因此成為非編碼RNA領域的研究熱點。

circRNA根據不同的組成和循環機制可以分為4類：外顯子circRNA、內含子circRNA、外顯子-內含子circRNA和tRNA內含子所形成的circRNA。目前存在3種假設模型來解釋外顯子circRNA的形成[1]。（1）套索驅動的環化，指由外顯子組成的剪接供體和剪接受體共價結合；（2）內含子配對驅動的環化，由2個內含子互補配對結合從而形成環化結構；（3）RNA結合蛋白誘導的環化，由前體RNA的內含子兩側的RNA結合蛋白相互作用形成環狀結構，發生末端連接，形成circRNA。

circRNA是一類具有顯著特征的RNA分子。（1）高豐度，circRNA廣泛表達于各種物種中，在人類細胞中circRNA占所有轉錄本的10%以上[2]；（2）穩定性，無5'帽子和3'poly A尾的結構特征使環狀RNA具有對核糖核酸酶的消化抗性，大多數環形RNA的半衰期超過48 h，而其線性對應物的半衰期＜20 h[3]；（3）保守性，circRNA的保守性主要表現為哺乳動物之間circRNA的共同表達，例如，大約15 000個circRNA在人類和小鼠的同源基因座中均有表達，分別占人類和小鼠circRNA總量的15%和40%[4]；（4）特異性，circRNA通常以細胞特異性和組織特異性方式表達，例如由外顯子組成的circRNA通常位于細胞質中[5]；（5）在人類和小鼠中，circRNA傾向于在大腦和血小板中富集[6]。

目前研究認為，circRNA具有強大的生物學功能。（1）通過“海綿作用”吸附微小RNA（microRNA，miRNA）。circRNA上存在miRNA結合位點，可以結合特定的miRNA，調節miRNA和mRNA的結合，發揮競爭性內源RNA的功能。高水平的circ_0020710可以通過結合miR-370-3p來上調趨化因子CXC配體12（CXC-motif-chemokine 12，CXCL12）表達。CXCL12的下調可逆轉由circ_0020710表達引起的黑色素瘤細胞的惡性行為[5]。（2）吸附RNA結合蛋白（RNA-binding protein，RBP）。在細胞質中表達的circRNA能與蛋白質結合，進而抑制蛋白質向細胞核的運輸。circZKSCAN1可充當RBP海綿，與脆性X智力低下蛋白（fragile X mental retardation protein，FMRP）靶基因CCAR1競爭，隨后使Wnt/β-catenin信號通路失活從而抑制腫瘤行為[7]。（3）編碼蛋白質和多肽。circ-MALAT1在臨床肝細胞癌樣本的癌癥干細胞中高表達，circMALAT1通過與核糖體和mRNA形成三元復合物，阻止PAX5 mRNA的翻譯并促進癌癥干細胞的自我更新[8]。（4）調節基因轉錄和選擇性剪切。circRNA可通過與RNA聚合酶Ⅱ以及其他轉錄因子相互作用來調節親本基因的表達。

目前用于檢測circRNA的方法有很多種，各個檢測方法都有一定的優點與局限性，見表1。

表1 常用檢測circRNA的方法

2 circRNA在腫瘤生長和轉移過程中的作用

circRNA在腫瘤細胞的增殖和轉移過程中發揮著重要作用，在細胞周期、上皮間質轉化，以及增殖與轉移相關信號通路中circRNA作用均有最新成果。

2.1 circRNA對細胞周期相關蛋白/激酶的調控

細胞周期的進展是高度有序、逐步發生的，主要受cyclin細胞周期素、細胞周期素依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）以及細胞周期素依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI）的控制。因此，細胞周期各階段推進的核心機制是cyclin、CDK、CKI之間合成組裝、修飾活化、拆卸降解和轉換的過程。

circRNA參與調節周期蛋白或激酶的表達，被認為是細胞周期的基本參與者。ZHENG等[14]發現，來源于NR3C1的circRNA（circNR3C1）在膀胱癌組織和細胞系中表達量顯著下調，circNR3C1直接作用于miR-27a-3p可阻止其與cyclinD1 mRNA 5'UTR的相互作用，并隨后通過抑制cyclin D1蛋白的表達來抑制細胞周期進程。同樣，在肝癌細胞中has-circ-0000204可以通過“海綿作用”吸附miR-191，miR-191的上調抑制了Kruppel樣因子6（Krüppel-like factor 6，KLF6） mRNA和蛋白表達，從而促進了G1-S/G2-M期的過渡[15]，KLF6屬于鋅指轉錄因子家族成員，其靶標蛋白有P21、cyclin D、c-MYC等，在細胞增殖和細胞周期中扮演著非常重要的角色。circ-ZKSCAN1是使用circRNA微陣列技術在膀胱癌中篩選出表達顯著下降的circRNA，circ-ZKSCAN1可以充當miR-1178-3p海綿，通過削弱miR-1178-3p使靶標蛋白P21的mRNA和蛋白表達上調，進而其抑制膀胱癌細胞的增殖和侵襲[16]。與此類似，BCRC-3在膀胱癌組織中表達降低，通過RNA下拉實驗確認miR-182-5p是其唯一結合的miRNA，P27是miRNA結合的靶基因，因此circ-BCRC-3可以直接結合膀胱癌細胞中的miR-182-5p，從而促進下游效應子p27的表達[17]。DU等[18]的研究發現，circ-Foxo3的表達抑制了細胞增殖和細胞周期進程，circ-Foxo3在細胞內可以與P21、CDK2形成circ-Foxo3/p21/CDK2三元復合物，這個復合物的形成，不但使p21阻止了CDK2作用于cyclin E，避免了cyclin E/CDK2復合物的形成，從而阻斷了G1期向S期的過渡，同時其還能消除p21對cyclin A/CDK2復合物的抑制作用，從而阻斷S期細胞周期的進展。同樣，circ-Ccnb1可以與cyclin B1和CDK1結合，從而解除cyclin B1/CDK1復合物的形成和核轉移，使Ccnb1和CDK1不能發揮有絲分裂活性，抑制了腫瘤的生長并延長了小鼠的生存能力[19]。

2.2 CircRNA與上皮間充質轉化相關蛋白

上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）是細胞侵襲和轉移的關鍵驅動因素，其中上皮標志物E-鈣黏蛋白（E-cadhefin，E-cad）的表達下降是EMT的重要標志。Snail、Twist、Slug和ZEB等EMT相關的轉錄因子可以與E-cad的E-box結合調節EMT。

Snail是轉錄阻遏物，它與E-box序列的調節區和啟動子結合，調節許多不同基因的表達，并以此方式調節EMT。在膀胱尿道上皮癌中，circPRMT5的表達上調且circPRMT5會吸附miR-30c，通過circPRMT5/miR-30c/Snail1/E-cadherin途徑促進尿道上皮癌細胞的EMT[20]。同樣，在宮頸癌細胞中發現circRNA_000284上調，miR-506已被鑒定為circRNA-000284相關miRNA，Snail-2是miR-506的直接靶標，因此，circRNA-000284可以間接增加Snail-2的表達并促進侵襲和轉移[21]。ZEB由ZEB1和ZEB2組成，與Snail基因家族成員相似，ZEB家族成員通過其2個鋅指結構域與E-cadherin基因啟動子中的E-box結合并觸發EMT。例如CircNUP214在甲狀腺乳頭狀癌細胞中發揮致癌作用，CircNUP214充當miR-145的海綿，而ZEB2是miR-145的功能靶標，CircNUP214/miR-145/ZEB2軸在甲狀腺乳頭狀癌的發病機制中起關鍵作用[22]。Twist是一種重要的EMT，可直接或間接控制EMT相關基因的轉錄。有研究結果表明，Twist1通過與泛素化連接酶2（Cullin 2，Cul2）啟動子結合來促進Cul2轉錄并上調Cul2的circRNA（circ-10720）表達，但抑制Cul2表達，circ-10720與Twist1正相關，并促進了EMT進展，因此circ-10720通過吸附miR-490-5p來上調波形蛋白的表達[23]。KLF屬于含鋅指的轉錄因子家族，可調節細胞增殖、分化和凋亡。ciRS-7在食管鱗狀細胞癌中過表達，并可通過調節miR-7/KLF4軸和激活核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）-p65信號來觸發食管鱗狀細胞癌的遷移和侵襲[24]。

除了以上circRNA在轉錄因子的調控作用外，某些circRNA還通過直接或間接調節細胞黏附分子和細胞骨架蛋白的表達來發揮作用。例如：波形蛋白[25]、原鈣黏蛋白α[26]、神經性鈣黏素[27]等，此類失調的circRNA可以充當腫瘤抑制因子或致癌基因，以控制細胞增殖、侵襲和轉移。我們總結了近年來circRNA在腫瘤增殖和轉移中的作用，見表2。

2.3 circRNA與生長和轉移相關信號通路

circRNA除了對上述蛋白分子進行調控之外，還對腫瘤增殖和轉移的相關通路發揮著重要作用。SU等[28]的研究發現，circRIP2可吸附miR-1305，升高膀胱癌中的TGF-β2，并通過TGF-β2/Smad3途徑誘導EMT，在膀胱癌中阻斷TGF-β2會使circRIP2誘導的癌癥進展和EMT喪失。CircMYO10通過吸附miR-370-3p上調RUVBL1促進染色質重塑而促進骨肉瘤進展，RUVBL1與β-catenin/LEF1復合物的結合增強β-catenin/LEF1復合物的轉錄活性[29]。在神經膠質瘤中，circNFIX通過靶向miR-34a-5p調控Notch1和Notch信號通路[30]。ZHANG等[31]的研究發現，在胃癌中有較高的circNRIP1表達，circNRIP1的下游是miR-149-5p，通過circNRIP1-miR-149-5p-Akt1/mTOR軸負責胃癌細胞中新陳代謝的改變，Akt/mTOR途徑是介導腫瘤代謝穩態的經典信號途徑之一，對腫瘤的生長和轉移有益。circRNA-000911在乳腺癌細胞中起抗癌作用，miR-449a是circRNA-000911潛在的miRNA，circRNA-000911通過使miR-449a海綿化而正向調節Notch1表達，有學者鑒定出NF-κB信號通路是circRNA-000911/miR-449a途徑的功能靶標[32]。見表2。

表2 circRNA在腫瘤增殖和轉移中的作用

3 總結和展望

circRNA的發現豐富了人們對腫瘤生物學的認知，加深了對RNA更全面的理解，使其成為腫瘤生長和轉移研究領域的熱點，也為檢驗診斷開拓了新方向。常規檢驗已經被證明是很有前途的，但是開發臨床驗證的腫瘤檢測生物標志物仍是一個挑戰。近年來，circRNA在腫瘤增殖和轉移方面是非常有潛力的腫瘤標志物。例如，血清circSETDB1在高級漿液性卵巢癌中上調，較高水平的circSETDB1與漿液性卵巢癌患者的臨床分期、淋巴結轉移呈正相關；原發化學耐藥患者的血清circSETDB1水平顯著增加，circSETDB1水平較高的患者的無進展生存期較短，因此血清circSETDB1可以作為一種新型的非侵入性生物標志物[33]。circMUC16在上皮性卵巢癌患者血清中的表達增加，其表達與腫瘤的分級和分期有關，因此，circMUC16可以作為上皮性卵巢癌的潛在生物標志物[34]。exo-hsa_circRNA_0056616的表達與肺腺癌的T期、M期和TNM分級之間存在顯著負相關，因此，exo-hsa_circRNA_0056616是有價值的淋巴結轉移性肺腺癌的診斷學生物標志物[35]。在多發性骨髓瘤患者中，hsa_circRNA_101237的表達升高，hsa_circRNA_101237可以用作多發性骨髓瘤新的診斷和預后生物標志物以及潛在的治療靶標[36]。總之，circRNA在生物標志物的開發中顯示出巨大的潛力，與線性RNA相比，具有環狀結構的circRNA更穩定并且具有較長的半衰期，因此更適用于生物標志物的開發。雖然circRNA在檢驗診斷方面的應用還處于初級階段，但是對大量臨床樣本的研究展現了其良好的臨床應用價值，未來需要挖掘更多更有意義的circRNA，進一步評估其在臨床檢驗工作的實際作用。相信隨著新一代RNA測序技術的發展以及對更多臨床樣本的研究，circRNA會成為檢驗診斷和臨床治療的新模型。