小豆種質資源總黃酮含量測定及其與農藝性狀相關分析

劉靖崧 謝繼芳 楊 凱 趙 波 李奕松 萬 平

(農業應用新技術北京市重點實驗室；北京農學院植物科學技術學院1，北京 102206)(農業農村部華北都市農業重點實驗室；北京農學院生物與資源環境學院2，北京 102206)

小豆(VignaangularisL.)，起源于中國，屬豆科(Leguminosae)、 菜豆族(Phaseoleae)、 豇豆屬(Vigna)，在我國已有12 000年栽培歷史[1]，是重要的食用豆之一，在世界上30多個國家種植。Yamaguchi等[2]根據生態學、形態學等主要特征，將小豆分為栽培種、野生種和半野生種。中國具有豐富的小豆種質資源并且表現出較高的遺傳多樣性[3]。小豆籽粒含小豆皂苷、三萜、類黃酮和多酚等生物活性物質，具有祛濕、消腫、解毒、降血糖血脂、減肥、降低膽固醇等保健功能和藥用價值[4]。類黃酮對人體健康有多種益處，有抗氧化[5]、抗菌[6]、抗癌[7]等作用，黃酮類化合物的研究是國內外研究的熱點之一。

迄今，小豆中有關來源廣泛的種質資源材料類黃酮含量測定和野生小豆類黃酮含量分析鮮見報道。本研究采用紫外分光光度法測定279份小豆籽粒中黃酮類化合物含量，比較了栽培小豆及其祖先種野生小豆種質資源總類黃酮含量的差異，分析了總類黃酮含量與籽粒性狀、Lab值之間的相關性，旨在建立和完善小豆類黃酮含量測定體系，篩選優異種質資源，挖掘優異基因，為小豆高類黃酮含量生物強化育種和GWAS分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料由北京農學院食用豆研究團隊提供，共279份來源廣泛的野生、半野生和栽培小豆種質資源自然群體，包括中外栽培小豆213份(160份地方品種和53份育成品種)、中外野生小豆35份、中外半野生小豆31份(表1)。材料種植于北京農學院實驗基地，成熟后收獲種子。

表1 供試材料列表

1.2 方法

1.2.1 總黃酮的提取及測定

將小豆種子放入FW100高速萬能粉碎機中粉碎磨細，過100目篩，后在42 ℃干燥箱中干燥過夜，取粉末約0.2 g，3次重復，精密稱定于2 mL離心管中，加入1 mL 80%甲醇(分析純)，渦旋處理10 min讓樣品與溶劑充分混合，40 Hz條件下超聲提取90 min，后12 000 r/min離心20 min，倒出上清待用。

取提取液上清100 μL，加入ddH2O 800 μL，5% NaNO260 μL，混合均勻，5 min后，加入10%AlCl360 μL混勻，靜置，10 min后，加入400 μL 1 mol/L NaOH，再加入ddH2O補至2 mL，分光法測定510 nm處吸光值?？瞻讓φ諡樗?，其他操作相同。使用蘆丁作為總黃酮的標準品配制成不同濃度，按操作步驟制作標準曲線，根據讀數在標準曲線中測定總黃酮濃度，總黃酮含量用mg蘆丁當量RE/g表示。測定儀器為UV-2100型紫外可見分光光度計。

設置14個梯度10～75 μg/mL，精密量取蘆丁標準品配成溶液用于標準曲線測定。以吸光度A為縱坐標，濃度C(μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為y=0.011 2x-0.002 2，R2=0.997 5，蘆丁在10～75 μg /mL濃度范圍內，吸光度與濃度呈良好線性關系。

1.2.2 農藝性狀調查及測定

田間性狀調查和室內性狀考種按照《小豆種質資源描述規范和數據標準》[23]和《The AsianVigna: genusVignasubgenusceratotropisgenetic resources.》[24]標準進行。田間調查包括：現花期、盛花期、第一莢成熟和100%成熟。掛牌單株進行室內考種，收獲的種子用SC-G型自動考種分析及千粒重儀，正片掃描自動導出種子性狀相關參數，包括百粒重、面積和單株產量。具體調查性狀及調查標準見表2。

表2 農藝性狀調查標準

使用cR400b色彩色差計進行測定[25]。用1976年cIE制定的Lab表色系的方法測定小豆粒色的Lab值，Lab分別代表著亮度值、紅度值和黃度值。測定過程中，在每個單株中隨機抽取25粒左右較好的籽粒，擦凈并且使所有籽粒的種臍背對測量儀器進行測定。每份材料取3株進行測定，每株測定3次。

1.2.3 數據分析

使用IBM SPSS Statistics17分析數據，基于Pearson相關性(雙尾)的雙變量相關性確定不同性狀之間相關性的顯著性。

2 結果與討論

2.1 小豆總黃酮含量分析

不同小豆種質資源間總黃酮含量差異明顯，栽培小豆中育成和地方品種的總黃酮含量均值分別為2.95 mg RE/g和3.31 mg RE/g，半野生和野生小豆分別為3.55 mg RE/g和4.06 mg RE/g(表3)。野生小豆總黃酮含量顯著高于半野生小豆、地方品種和育成品種，半野生小豆和地方品種總黃酮含量顯著高于育成品種，半野生小豆和地方品種間總黃酮含量差異未達顯著水平。不同小豆變異系數存在差異，且與材料份數有關，依次是地方品種、育成品種、野生小豆和半野生小豆，地方品種多樣性高。野生小豆總黃酮含量普遍偏高，含量高于3.56 mg RE/g的材料約占75%；半野生小豆高于3.52 mg RE/g的材料約占55%；地方小豆高于3.56 mg RE/g的材料約占37%；育成小豆總黃酮含量偏低，含量高于3.57 mg RE/g的材料僅占19%，約60%材料的總黃酮含量集中分布在2.30～3.50 mg RE/g之間。在小豆馴化選擇進程中，總黃酮含量降低。

表3 不同類型小豆總黃酮含量

大豆類黃酮主要是異黃酮，來永才等[26]分析黑龍江省247份野生和栽培大豆異黃酮含量，明確了野生大豆異黃酮平均含量高于栽培大豆。林紅等[27]測定60份野生和栽培大豆的含量異黃酮含量，野生大豆平均含量3.020 mg/g，育成品種平均2.686 mg/g。周三等[28]研究表明，野生大豆的異黃酮的總含量大于普通栽培大豆，與本研究結果相同。王春娥等[22]測定野生大豆、地方品種與育成品種大豆異黃酮總含量分別為2.995、3.241、2.705 mg/g，地方品種平均值與變幅均大于野生大豆，育成品種平均值與變幅則低于野生大豆，顯然小豆的總黃酮含量較高。栽培小豆總黃酮含量普遍低于野生小豆，可能是由于黃酮類物質引起豆制品苦澀味和影響品質29]，而由人工選擇降低。

不同研究中用兒茶素為標樣測定小豆總黃酮平均含量分別為2.75 mg CE/g[30]、5.81 mg CE/g[31]；Woo等[32]測定7個韓國小豆品種的總黃酮為2.61～28.95 mg CE/g，變異幅度大；Lee等[22]用槲皮素作標樣測定小豆的總黃酮含量0.17～0.91 mg QE/g。本研究以蘆丁為標樣測定279份野生和栽培小豆種質的總黃酮含量平均值為3.47 mg RE/g(1.12～5.97 mg RE/g)，可見小豆中蘆丁、兒茶素含量高于槲皮素。Liu等[21]研究表明小豆主要有兒茶素、牡荊素-4”-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-蕓香苷。Wang等[14]研究顯示大豆、豇豆、綠豆和小扁豆中兒茶素含量分別為0.892、0.441、0.111、0.08 mg/g。Gan等[15]測定大豆、豇豆和綠豆中兒茶素含量分別是0.785、3.34、0.971 mg CE/g，比較而言小豆的兒茶素含量較高。

初步分析不同中國地理來源栽培小豆種質資源總黃酮平均含量，甘肅、貴州和寧夏資源總黃酮含量最高，超過4.00 mg CE/g；云南、湖北、陜西、湖南資源其次。北方地區來源材料普遍低于南方地區，但吉林省來源材料除外，推測有些來自吉林可能有的系由南方引進或有南方地區及日本的血統。北京市、天津市、山東省較低，河北省和黑龍江省最低；廣東省和浙江省來源的材料總黃酮含量最低，可能是由于海拔低。黃酮含量總體趨勢是由西南地區向東北地區降低，隨著經緯度升高而降低的趨勢(表4)。除此之外，結合中國地形圖分析發現，中國栽培小豆總黃酮含量分布圖與其重合度較高，即中國栽培小豆總黃酮含量隨著海拔降低而降低，進一步分析需要測定多年多點種質資源的黃酮含量。有研究表明海拔升高可以增加類黃酮含量和抗氧化能力，因為在較高海拔處的太陽輻射的增加導致正二羥基化類黃酮的生物合成增加，本結果與Yao等[33]研究一致。

表4 不同地域栽培小豆總黃酮含量情況

2.2 總黃酮含量與農藝性狀的相關性分析

小豆總黃酮平均含量與農藝性狀相關性分析顯示總黃酮含量與現花期、盛花期、第一莢成熟、100%成熟呈極顯著正相關，與籽粒亮度值L呈顯著正相關，與百粒重、種子面積、紅度值a、經度呈極顯著負相關，與緯度呈顯著負相關，與單株產量和黃度值b未達顯著水平，與面積相關性最大(R=-0.404，P<0.01)(表5)。種子小的小豆種皮與籽粒的比表面積相對較大，而黃酮類物質主要存在于豆類物質的種皮中[36]，故種子小的小豆種質資源總黃酮含量較高，相對營養好于大粒。野生小豆生長在自然環境條件下，多在生態條件破壞少的山區存留，繁殖系數高，百粒重小于3 g；種子小合成相對較多的黃酮類次生代謝物利于克服逆境[37]。Lab色彩模式是一種顏色標定模式，L代表亮度值，范圍在0～100，最暗為0，最亮為100，a是由綠到紅的色彩變化值，范圍在-128～+128，純綠為-128，純紅為+128，b是由藍到黃的色彩變化值，范圍在-128～+128，純藍為-128，純黃為+128 ；L、a、b值分別代表了小豆的粒色情況，小豆種子總黃酮的含量與種皮的顏色相關，暗色籽粒小豆總黃酮含量低于亮色，紅色種皮小豆總黃酮含量低于綠色。

表5 小豆總黃酮含量與農藝性狀的相關系數

3 結論

通過對279份來源廣泛的中外野生、半野生和栽培小豆種質資源自然群體的總黃酮含量的測定，野生小豆和栽培小豆間差異明顯。小豆種質資源總黃酮含量變異廣泛，變幅為1.12～5.97 mg RE/g，變異系數為21.66%；總黃酮含量為野生小豆>半野生小豆>地方品種>育成品種。小豆總黃酮含量與現花期、盛花期、第一莢成熟、100%成熟呈極顯著正相關，與籽粒亮度值L呈顯著正相關，與百粒重、面積、紅度值a、地理經度呈極顯著負相關，與地理緯度呈顯著負相關。與面積相關性最大(R=-0.404，P<0.01)。小豆籽粒總黃酮的含量和種皮的顏色相關，亮度值低的籽?？傸S酮含量低于亮度值高的，紅色種皮小豆總黃酮含量低于綠色。不同地理來源的小豆，總黃酮含量隨著經緯度升高而降低，隨著海拔降低而降低。