基于函數擬合碘值及脂肪酸成分配制功能性復合油的研究

丁澤人 楊曉君 胡衛成 唐洪松 鄭萬財

(新疆農業大學食品科學與藥學學院1,烏魯木齊 830052)(淮陰師范學院;江蘇省高校區域現代農業與環境保護協同創新中心2，淮安 223300)(內江師范學院經濟與管理學院3，內江 641000)

紅花籽油具有降低血清中膽固醇含量，防止膽固醇在血管壁沉積，防治動脈粥樣硬化及心血管疾病的作用[1-3]。α-亞麻酸(ω-3脂肪酸)僅存在于少量特定的植物籽油中如蘇子油、亞麻籽油和核桃油等[4-6]。α-亞麻酸對猴動脈粥樣硬化有減輕，促進其消退的作用[7,8]，抑制肝臟膽固醇和NF-kB表達[9]，還有輔助改善記憶能力的作用[10]。LA(ω-6)和ALA(ω-3)在體內的吸收利用具備競爭性，其攝入量和二者比例成為研究熱點，臨床研究發現ω-6/ω-3比率為4∶1時，則心血管疾病的病死率下降70%[11]；不同比例亞油酸和亞麻酸對雞原代干細胞增殖的影響的實驗結果表明：LA/ALA=10時細胞增殖能力最強[12]；考察ω-6/ω-3脂肪酸平衡對動脈粥樣硬化的影響[13]，核桃油、紫蘇油以及α-亞麻酸、亞油酸對斷奶幼鼠學習記憶的影響及其機制的研究結果證實單純補充α-亞麻酸、亞油酸不能有效降低實驗動物血脂及提高斷奶幼鼠的空間學習記憶能力，將植物油脂制備成游離態的多元不飽和脂肪酸混合物后與天然多不飽和脂肪酸三甘酯復配后能增強主要活性物質的功能性和穩定性[14-20]。

課題組前期研究證實將紅花籽油(富含順式亞油酸LA，還含有ALA及其他脂肪酸，三甘酯態)與亞麻籽油提取物(主要成分為游離態的α-亞麻酸ALA，還含有LA及其他脂肪酸)復配制成LA∶ALA滿足1∶1～2的紅花籽亞麻籽多不飽和脂肪酸脂肪酸復合油具有良好的降血脂效果。將亞麻籽油制備成亞麻籽提取物后，其中的ALA由三甘酯態轉變為游離態，使ALA在胃腸道中的吸收率升高，生物活性會升高，代謝轉化時相比于三甘酯態的ALA少了脂肪動員水解步驟，能更快進入血液供組織攝取利用；亞麻籽油制備成亞麻籽提取物后，穩定性降低，三甘酯態的紅花籽油穩定性好為亞麻籽油提取物中的游離態ALA提供保護，還能調整復合油中的脂肪酸比例，使復合油中LA∶ALA滿足1∶1～2這一必須條件[21-24]。然而將多種油脂或脂肪酸復配以使其脂肪酸組成滿足一定的比例，目前尚無簡便的方法，在實際生產中，需要多次反復實驗，多次GC-MS成分分析才能配制出滿足要求的產品，又因每批次所用原料的差異,另批生產時又需從原料的脂肪酸組分分析作起；復配周期長，成本高，成為該復合油實際生產應用中的限制性問題，前期研究發現亞麻籽油提取物及紅花籽亞麻籽多不飽和脂肪酸復合油中ALA含量與其碘值有相關性[25]；油脂或脂肪酸碘值檢測方法的基本原理是利用動植物油脂中不飽和脂肪酸的雙鍵與鹵素定量加成；國標GB/T 5532—2008采用的碘劑是 “韋氏試劑”，活性成分為ICl[26]；在依照國標測定碘值，利用GC-MS檢測脂肪酸組成含量的前提下，碘值與油脂中尤其是多不飽和脂肪酸復合油中多不飽和脂肪酸的含量或比值存在相關性；基于此，可利用油脂或提取物的實測碘值作為衡量油脂或提取物中已確定的不飽和脂肪酸種類的含量依據，可利用“連續函數求和原理”和“復合函數連續定理”[27]進行擬合制定紅花籽亞麻籽多不飽和脂肪酸復合油的碘值-脂肪酸組成及(ALA∶LA)比例復配標曲。

1 材料與設備

1.1 主要儀器設備

Agilent 7890A-5975C GC-MS，RE-52B旋轉蒸發儀，DZTW電熱套，PL2002電子天平，XHF-DY高速剪切分散器，PHS-3C型pH計，SF-GL-16A高速冷凍離心機，80-2沉淀離心器。

1.2 主要試劑

紅花籽油、亞麻籽油、亞麻籽油提取物、三氟化硼二水合物、環己烷、十二烷基苯磺酸鈉、甲醇、氫氧化鈉、硫酸、氯化鈉、硫酸鈉、無水碳酸鈉、韋氏試劑、硫代硫酸鈉、可溶性淀粉皆為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 亞麻籽油提取物的制備

依照課題組前期皂化中和純化一體化制備亞麻籽油提取物工藝[28]，先依GB/T 5534—2008測定亞麻籽油的皂化值，作為高速剪切皂化-冷凍分離法制備亞麻籽提取物時皂化過程中加入堿量的依據，制備亞麻籽油提取物時，按皂化值的1.5倍量加入堿進行高速剪切皂化；皂化完畢，在高速剪切條件下加稀硫酸中和后自來水、蒸餾水反復洗滌；取上層清液，不同溫度條件反復冷凍-離心分離棄去下層沉淀，得上層清液經無水硫酸鈉除水后即為亞麻籽油提取物。

1.3.2 油脂樣品碘值的測定

本實驗涉及到的油脂樣品：亞麻籽油、紅花籽油、亞麻籽油提取物、紅花籽亞麻籽多不飽和脂肪酸復合油皆依GB/T 5532—2008所規定的方法測定各自的碘值。各樣品的碘值測定為后續制定“碘值-脂肪酸組成及(ALA∶LA)比例復配標曲”提供相應的碘值數據，對依照標曲配制的不同ALA∶LA值紅花籽亞麻籽多不飽和脂肪酸復合油碘值測定用于檢驗標曲是否適用。

1.3.3 亞麻籽油、紅花籽油、亞麻籽油提取物的脂肪酸組成GC-MS分析

依GB/T 17376—2008之三氟化硼法對亞麻籽油、紅花籽油甲酯化后進行GC-MS檢測，分析其脂肪酸組成，為后續制定“碘值-脂肪酸組成及(ALA∶LA)比例復配標曲”提供相應的脂肪酸組成數據；對依標曲配制的不同ALA∶LA值紅花籽亞麻籽多不飽和脂肪酸復合油進行GC-MS檢測，分析其脂肪酸組成，檢驗利用標曲是否能依據測定的碘值準確的配制指定ALA∶LA值的紅花籽亞麻籽多不飽和脂肪酸復合油。GC檢測條件：色譜柱：HP-5MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm毛細管柱；進樣量：0.2 μL；分流比：100∶1；升溫程序：起始溫度為50 ℃，以10 ℃/min升溫至210 ℃，然后以3 ℃/min升溫到240 ℃，再以10 ℃/min升到300 ℃/min保持5 min。運行時間：37 min。MS檢測條件：電離方式：EI；電離能量：70 eV；離子源發生器溫度：230 ℃；質量掃描范圍：30～700 amu；溶劑延遲：3 min。

1.3.4 基于函數擬合碘值-脂肪酸組成繪制復合油配制標曲的繪制方法

“連續函數求和原理”和“復合函數連續定理”結合到紅花籽亞麻籽多不飽和脂肪酸復合油的“碘值-脂肪酸組成及(ALA∶LA)比例復配標曲”制備則可表述為：若不同濃度水平紅花籽油、亞麻籽油提取物的碘值與其各自LA、ALA含量繪制的相應曲線性度良好，且它們曲線方程形式一致，則由紅花籽油和亞麻籽油提取物復配制備的紅花籽亞麻籽多不飽和脂肪酸復合油其不同濃度水平的碘值與其LA、ALA含量或比值能擬合繪制線性度良好的相應曲線。由此，能將亞麻籽油提取物與紅花籽油不同比例復配，并進行GC-MS檢測，獲知其ALA∶LA值；同時測定其碘值，以碘值對應ALA∶LA值制定“碘值-脂肪酸組成及(ALA∶LA)比例復配標曲”，還可以為了表達的簡便，用單調函數如對數等將碘值或ALA∶LA比例轉換。

1.3.4.1 紅花籽油、亞麻籽油提取物脂肪酸組成-碘值曲線繪制方法

本研究對47例老年肺炎患者及20例健康老人的血清PCT、hs-CRP及D-Dimer水平進行了檢測和比較，結果顯示老年肺炎患者血清PCT、hs-CRP及D-Dimer水平明顯高于對照組(P＜0.05)，可能是因為發生肺炎等肺部疾病時，患者機體存在的炎癥反應會激活機體應急反應及凝血系統，最終表現為上述3個指標的升高，本研究還發現高危組老年肺炎患者血清PCT、CRP及D-Dimer水平明顯高于中危及低危2組患者，且其升高水平與肺炎嚴重程度呈正相關，隨著患者病情越重，其濃度越高。

依據“連續函數求和原理”和“復合函數連續定理”，先對紅花籽油、亞麻籽油提取物的脂肪酸組成進行GC-MS分析，明確兩者脂肪酸組成，再將兩種配制原料以環己烷稀釋成不同濃度，取同體積，分別測定其碘值，繪制各自脂肪酸組成-碘值曲線，看兩種復合油配制原料的碘值是否與其脂肪酸組成變化成線性關系，判斷連續性和單調性。

故精確稱取紅花籽油、亞麻籽油提取物，分別以色譜純環己烷為稀釋劑配制濃度(w/w)為0、20%、40%、60%、80%、100%的系列溶液，恒定其質量為100 g，依照GB/T 5532—2008 動植物油脂碘值的測定”規定的碘值檢測方法進行碘值測定；先依照紅花籽油、亞麻籽油提取物的GC-MS檢測結果計算不同濃度溶液中ALA和LA的含量(mol)；再將兩者不同濃度環己烷溶液中所含ALA、LA的量分別與不同濃度紅花籽油、亞麻籽油提取物環己烷溶液碘值均值擬合繪制曲線；分別求證紅花籽油、亞麻籽油提取物中特定的ALA、LA脂肪酸組分含量的變化是否與紅花籽油、亞麻籽油提取物的碘值呈線性關系。

1.3.4.2 復合油的碘值-脂肪酸組成及(ALA∶LA)比例復配標曲繪制方法

依“復合函數連續定理”和“復合函數連續定理”若兩種復合油的配制原料與其脂肪酸組成變化成線性關系，則將亞麻籽油提取物與紅花籽油不同比例復配，并進行GC-MS檢測，獲知其ALA∶LA值；同時測定其碘值，以碘值對應ALA∶LA值制定“碘值-脂肪酸組成及比例復配標曲”。

故以紅花籽油、亞麻籽提取物為原料配制系列紅花籽油加入量不同的復合油，依照前述脂肪酸組成GC-MS檢測方法對系列紅花籽油加入量不同的復合油進行脂肪酸組成分析，獲知其中LA、ALA的含量，計算系列復合油中LA∶ALA的值(w/w)；測定系列復合油的實際碘值，將配制復合油的紅花籽油加入比例(wt%)與復合油的實際碘值擬合繪制紅花籽油占比-復合油碘值復配標曲；將復合油中LA/ALA值倒數與復合油碘值的對數值(lgI2)擬合繪制LA/ALA值倒數-碘值對數值復配標曲；在紅花籽亞麻籽多不飽和脂肪酸復合油配制時可根據紅花籽油占比-復合油碘值復配標曲可以計獲知配制的復合油的碘值，由碘值可根據LA/ALA值倒數-碘值對數值復配標曲獲知復合油中LA/ALA值。

1.3.5 碘值-脂肪酸組成及(ALA∶LA)比例復配標曲的檢驗

3 結果

3.1 亞麻籽油提取物的制備

依照2.1所確定的方法，取100 g亞麻籽油經高速剪切皂化后中和洗滌，再經不同溫度條件下反復離心分離得到亞麻籽油提取物71.4 g，-20 ℃條件下冷凍避光保存備用。

3.2 亞麻籽油、紅花籽油、亞麻籽油提取物的碘值

依照GB/T 5532—2008規定的方法測定原料亞麻籽油、紅花籽油、亞麻籽油提取物的碘值見表1。

表1 亞麻籽油提取物、亞麻籽油、紅花籽油的碘值(gI/100 g)

3.3 亞麻籽油、紅花籽油、亞麻籽油提取物的脂肪酸組成

依照2.3的GC-MS檢測條件對亞麻籽油、亞麻籽油提取物、紅花籽油、脂肪酸組成進行分析，利用Famedb 23.L和NIST14.L兩數據庫交叉檢索對比，各油樣中GC-MS檢測數據與庫中數據符合置信度大于95%時，認為該油樣含有該物質，各組分的峰面積、百分含量由Lscint.p化學工作站積分器積分計算。各油樣中物質保留時間、峰面積、脂肪酸含量、匹配度等情況分別見表2～表4。

表2 亞麻籽油的GC-MS檢測結果

表4 紅花籽油的GC-MS檢測結果

3.4 基于函數擬合碘值-脂肪酸組成繪制復合油配制標曲

3.4.1 紅花籽油脂肪酸組成-碘值曲線

依照表4紅花籽油的GC-MS檢測結果計算不同濃度溶液中ALA和LA的含量；將不同濃度紅花籽油環己烷溶液中所含ALA、LA的量(mol)分別與不同濃度紅花籽油環己烷溶液碘值均值擬合繪制曲線，不同紅花籽油濃度中LA的含量與其實測碘值擬合曲線的方程為：Y=592.84X+8.318 3，R=0.996 0，線性度良好；不同紅花籽油濃度中ALA的含量與其實測碘值擬合曲線的方程為：Y=1 272X+8.298 2，r=0.996 0，線性度良好。

3.4.2 亞麻籽油提取物組成-碘值曲線

依照表3亞麻籽油提取物GC-MS檢測結果，同3.4.1操作，將亞麻籽油提取物中ALA、LA脂肪酸組分含量的變化與亞麻籽油提取物的碘值擬合，不同亞麻籽油提取物濃度中LA的含量與其實測碘值擬合曲線的方程為：Y=2 667.5X+7.893 3，r=0.998 1，線性度良好；不同亞麻籽油提取物濃度中ALA的含量與其碘值擬合曲線的方程為：Y=790.46X+7.820 5，r=0.998 0，線性度良好。

表3 亞麻籽油提取物的GC-MS檢測結果

不同濃度紅花籽油、亞麻籽油提取物中LA、ALA含量與其碘值擬合曲線線性度良好，且兩者LA、ALA含量與各自的碘值擬合曲線線性度接近，在兩者不同濃度環己烷溶液中LA、ALA的含量與其各自的碘值擬合所得曲線的方程形式一樣；證明盡管油的種類及脂肪酸狀態(三甘酯態和游離態)不同，但LA和ALA的組成含量-碘值曲線存在可擬合性。由此，若將紅花籽油與亞麻籽油提取物按照不同比例復配，則制備成的紅花籽亞麻籽多不飽和脂肪酸復合油中LA、ALA含量與復合油碘值可擬合成一條線性度良好的曲線。

3.4.3 基于函數擬合繪制的碘值-脂肪酸復配標曲

紅花籽油占比-復合油碘值復配標曲見圖1，復合油LA/ALA值倒數-碘值對數值復配標曲見圖2。

圖1 紅花籽油占比-復合油碘值復配標曲

圖2 復合油LA/ALA值倒數-碘值對數值復配標曲

紅花籽油占比-復合油碘值復配標曲的方程為：Y=-38.143X+180.24，r=0.985 4，線性度良好，復合油LA/ALA值倒數-碘值對數值復配標曲的方程為：Y=0.021 5X+2.188 3,r=0.973 3，線性度良好。

3.5 碘值-脂肪酸組成及(ALA∶LA)比例復配標曲的檢驗結果

若依照圖1、圖2所繪制的標曲，另取60%的紅花籽油與40%的亞麻籽油提取物復配時，LA∶ALA=1.837即可配制成滿足具備良好降血脂功能的紅花籽亞麻籽多不飽和脂肪酸復合油(LA∶ALA=1～2)，此時該復合油的碘值應為159.45。為驗證該標曲的準確性，將60%的紅花籽油與40%的亞麻籽油提取物復配利用GC-MS對其脂肪酸組成進行分析，并測量其碘值，考察其脂肪酸組成和碘值是否與標曲指示的一致，測定的碘值為159.70；GC-MS檢測結果的交叉對比檢索庫、置信度取舍、化學積分工作站等同2.3.2，其GC-MS總離子圖見圖3，其中所含各脂肪酸組分的各物質保留時間、峰面積、脂肪酸含量、匹配度等情況見表5。

圖3 新配60%紅花油與40%亞麻籽油提取物復合油的GC-MS總離子圖

表5 新配60%紅花油與40%亞麻籽油提取物復合油的脂肪酸組成GC-MS檢測結果

由表5可知，經GC-MS脂肪酸組分檢測，依照標曲配制的復合油中順式亞油酸(LA)的含量為45.3%，α-亞麻酸(ALA)的含量為24.24%，LA∶ALA=1.87，滿足課題實驗復合油中LA ∶ALA=1～2的要求且復合油中LA與ALA實際比值(LA∶ALA=1.87)與標曲中顯示的比值(LA∶ALA=1.83)接近一致。

若依照圖1、圖2所繪制標曲，將70%的紅花籽油與30%的亞麻籽油提取物復配制得的復合油，依照標曲，其碘值應為153.53，則其中LA：ALA=2.69；對該復合油進行GC-MS脂肪酸組成分析，其總離子流圖見圖4，脂肪酸組成分析結果見表6。

圖4 新配70%紅花油與30%亞麻籽油提取物復合油的GC-MS總離子圖

表6 新配70%紅花籽油與30%復合油的脂肪酸組成GC-MS檢測結果

由表6可知，經GC-MS脂肪酸組分檢測，依照標曲配制的70%紅花籽油與30%亞麻籽油提取物復合油中順式亞油酸(LA)的含量為59.70%，α-亞麻酸(ALA)的含量為21.09%，LA∶ALA =2.831，實測碘值為154.6；復合油中LA與ALA實際比值(LA∶ALA=2.83)與標曲中顯示的比值(LA∶ALA =2.690)接近一致，標曲碘值與實測碘值接近一致。

3.6 討論

本研究分別將紅花籽油、亞麻籽油提取物中LA、ALA組成含量與其各自的碘值擬合繪制曲線，考察各擬合曲線的方程形式和線性度以及單調性，看是否復合數學“連續函數求和原理”和“復合函數連續定理”；證實將紅花籽油與亞麻籽油提取物復配制備成紅花籽亞麻籽多不飽和脂肪酸復合油后，復合油中的LA、ALA的含量以及LA與ALA的比值依然與復合油的碘值可擬合，為了表達的簡便，用單調對數函數和倒數將碘值和ALA:LA比例轉換，由此制定出紅花籽油占比-復合油碘值復配標曲、LA/ALA值倒數-碘值對數值復配標曲，可以基于測量的碘值快速配制ALA∶LA比例明確的紅花籽亞麻籽多不飽和脂肪酸復合油，縮短了配制實驗周期，簡化了配制過程中的檢測手段，降低配制實驗成本。

在實際應用中可先明確擬進行復配的幾種油脂原料的脂肪酸組成，計算油脂中主要不飽和脂肪酸的含量，以不同比例的油脂原料復配制備系列復合油；依照脂肪酸組成檢測數據計算系列復合油中不飽和脂肪酸的含量；依照GB/T 5532—2008規定的碘值檢測方法進行復合油碘值測定；將復合油碘值與復合油中不飽和脂肪酸含量或多種不飽和脂肪酸含量比值擬合繪制相應的不同形式的“碘值-脂肪酸組成復配標曲”。若需要制備復合油的油脂原料中都不含有不飽和脂肪酸，則復配前和復配后的碘值接近，即不能依照“碘值-脂肪酸組成復配標曲”繪制方法制備相應的復配標曲；若制備復合油的油脂原料中有一種原料含有不飽和脂肪酸，不含有雙鍵的飽和脂肪酸相當于不飽和脂肪酸的溶劑，依然可利用本研究確立的“碘值-脂肪酸組成復配標曲”繪制方法制備相應的復配曲線。

4 結論

本研究基于“連續函數求和原理”和“復合函數連續定理”擬合GC-MS脂肪酸組分分析和碘值，制定出了“紅花籽油占比-復合油碘值復配標曲”(Y=-38.143X+180.24，r=0.985 4)及復合油LA/ALA值倒數-碘值對數值復配標曲(Y=0.021 5X+2.188 3，r=0.973 3)，對依照標曲復配的不同LA/ALA值紅花籽亞麻籽多不飽和脂肪酸復合油進行GC-MS脂肪酸組分分析驗證，證實標曲可用。這種通過函數擬合碘值與脂肪酸組成或比例變化，繪制相應復配標曲的方法對實際生產要求配制某些脂肪酸組分比例明確的復合油有一定的借鑒意義。