洛河污泥菌群分析及去除玉米赤霉烯酮的菌種篩選鑒定

李 旺 于思穎 程 鵬 張靜博

(河南科技大學動物科技學院，洛陽 471023)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)是一種特殊的生物毒素，屬于二羥基苯甲酸內酯類植物雌激素，最早從發霉的玉米中分離獲得的，它主要是由鐮刀菌屬真菌產生[1]。高低溫度的交替變化和較高的濕度是感染此類真菌并產生ZEN的主要原因，玉米、小麥及大豆等糧食和飼料作物一旦感染此類真菌便會含有大量玉米赤霉烯酮而具有毒性[2]。季海霞等[3]2015對收獲并入庫的飼用玉米進行取樣調查，結果顯示全國大部分玉米中玉米赤霉烯酮檢出率100%。Li等[4]連續3年調查顯示中國玉米、玉米副產物及飼料產品均受到不同程度的玉米赤霉烯酮污染。玉米赤霉烯酮對動物和人類的毒性主要有生殖發育毒性、致畸致癌毒性、免疫毒性、肝腎毒性以及內分泌系統毒性等[5,6]。如果不能有效控制和去除飼料和糧食中的ZEN，再好的動物品種和飼養方案也不能發揮最大的養殖潛力，人類健康計劃也會因糧食被ZEN污染而受到影響[7]。

自20世紀60年代初的首例霉菌中毒報告以來，全世界的研究人員都在研究如何有效地減少霉菌毒素帶來的不良反應。然而，現有的技術手段，仍然很難對ZEN進行有效的預測和防止[8]。目前，去除ZEN的方法有物理方法，如熱處理法、輻照法、吸附法；化學法，如臭氧、雙氧水、碳酸鈉等與玉米赤霉烯酮產生化學反應；物理法和化學法存在不易操作或破壞原料營養價值引起二次污染等弊端[9,10]。生物去除法是利用微生物產生的特異性的酶對玉米赤霉烯酮分解或者通過微生物及代謝物對毒素進行吸附。酶具有很強的專一性，不會對糧食和飼料等造成新的污染，也不會影響受污染飼料等的營養價值[11]。因此生物去除法成為脫毒、解毒研究的熱門話題[12,13]。已有報道顯示，去除玉米赤霉烯酮的微生物廣泛存在于自然界中，但關于去除玉米赤霉烯酮的相關研究多是對單菌的篩選，對去除菌中的種群研究較少[14,15]。因此，本實驗對洛河污泥樣品進行去除菌種群的分析，弄清同一個區域內存在哪些毒素去除菌種及其去除能力，改良篩選策略，為后續篩選出高效玉米赤霉烯酮去除菌種和組合應用這些菌種準備材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及來源

污泥樣品：采自洛河河道枯草密集區域的河道表層至深10 cm處，隨機從10個樣點采集污泥樣品，密封冷藏于實驗室備用。

1.1.2 培養基

MRS培養基：葡萄糖4 g，胰蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，牛肉膏2 g，MnSO4·4H2O 0.076 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，Tween-80 0.2 mL，K2HPO40.4 g，檸檬酸胺0.4 g(固體培養基加瓊脂粉3.2 g)，無菌水200 mL，pH 6.2～6.4。

LB培養基：胰蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，氯化鈉2 g(固體培養基加瓊脂粉3.2 g)，無菌水200 mL，pH 7.0～7.2。

NA培養基：牛肉膏0.6 g，蛋白胨2 g，氯化鈉1 g，無菌水200 mL(固體培養基加瓊脂粉3.2 g)，pH 7.2。

在各培養基中，添加5 μg/mL的玉米赤霉烯酮純品，用以做底物篩選去除菌種。

1.1.3 主要試劑

細菌基因組提取試劑盒、玉米赤霉烯酮ELISA檢測試劑盒、ZEN標準品(濃度>95%)，其他生化試劑和化學試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 污泥樣品宏基因組測序分析

細菌基因組DNA的提取與質量檢測：將10個污泥樣品各取1 g樣品混合均勻，按照細菌基因組提取試劑盒說明抽提總DNA，并對其進行質量檢測；DNA樣本檢測合格后，將其隨機片段化并篩選合適大小的插入片段進行文庫構建；構建好的文庫經過質檢合格后，使用Qubit3.0、QPCR和Qseq100精確定量，最后上機測序。

測序獲得的基因進行分類，在NR數據庫進行BLAST比對，比對到的物種，采用LCA(lowest common ancestor)算法，由種級別的分類向上追溯至第一個出現的公共分類級別，以此作為其注釋信息。統計樣本中注釋到各物種分類層級上的數量，并分析。

1.2.2 ZEN去除菌種的篩選與鑒定

在超凈臺中將10 g污泥樣品放入90 mL無菌水混合于150 mL三角瓶中，封口膜封口，置于搖床上震蕩30 min，配置10-1、10-2兩種稀釋梯度，取50 μL稀釋液滴在MRS、NA、LB等培養基上，用涂布棒將菌液在培養基上涂抹均勻，將各種培養基在37 ℃，厭氧和好氧條件下培養24～48 h，初篩微生物。篩選到微生物后，觀察菌落特征，革蘭氏染色，觀察菌體特征后，編號保存。

參照細菌基因組提取試劑盒說明書，提取所篩選菌種基因組DNA，擴增菌種的16SrDNA保守序列。對擴增產物進行測序，并通過NCBI Blast N進行保守序列的分析比對。PCR擴增體系為25 μL體系，包括2.5 μL 10×Ex Taq Buffer，2 μL dNTP，上、下游引物各1 μL，0.5 μL Ex Taq酶，1 μL模板(基因組DNA)，17 μL ddH2O。PCR反應條件及程序為：預變性94 ℃ 2 min→35個循環(變性94 ℃ 30 s→復性 57 ℃ 30 s→延伸 72 ℃ 1 min 30 s)→終延伸72 ℃ 10 min→ 4 ℃保存。

1.2.3 ZEN含量測定和去除率計算

挑取固體培養基上初篩的菌落于相應的液體培養基中，好氧培養于37 ℃搖床210 r/min搖動培養18 h，厭氧方式于37 ℃培養箱中靜置培養18 h，取出各菌種的培養液，冰箱冷藏保存。所篩菌種的培養液直接做待測樣品，用50%甲醇溶液1∶1混合提取后，濾紙過濾。然后按照玉米赤霉烯酮ELISA檢測試劑盒說明書的操作流程，測定培養液中玉米赤霉烯酮的含量，計算ZEN的去除率。

去除率=(添加ZEN—殘留ZEN)/添加ZEN×100%

2 結果與分析

2.1 宏基因組文庫的物種分析結果

利用宏基因組測序技術擴增污泥中微生物保守序列，并對基因序列進行相似性分析和比對，在“門”水平上與已有基因庫物種中相似性大于95%水平的微生物物種共有53 890個。分屬23個門，其中厚壁菌門物種基因豐度達99.4%，為主要優勢微生物群落。基于“目”水平的分析，相似性大于95%水平的微生物物種基因信息共有51 911個，分屬72個目，主要以芽孢桿菌目(Bacillales)和乳酸菌目(Lactobacillales)為主，分別占微生物菌株總數的64.5%和18.9%。基于“屬”水平可分析，鑒定的47 683個菌株分屬374個屬，主要菌屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus、Amphibacillus)和雙枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)，所占比例分別達為26.5%、14.9%、14.0%、11.0%，其中芽孢桿菌屬包含了11 026個菌株基因信息，是最主要的屬(圖1黑點)。鑒定到“種”水平的微生物菌株共32 199株，屬于1 568種微生物，其中枯草芽孢桿菌族(Bacillussubtilisgroup)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、 達蒙海洋桿菌(Oceanobacillusdamuensis)、 植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、大型海洋桿菌(Oceanobacillusmassiliensis)、蠟樣芽孢桿菌族(Bacilluscereusgroup)、兼性芽孢桿菌(Amphibacillusxylanus)、枝芽孢桿菌(Virgibacilluspantothenticus)、解淀粉慢桿菌(Lentibacillusamyloliquefaciens)、短小乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)為主要物種。其中枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、達蒙海洋桿菌、植物乳桿菌分別包含2 188、1 794、1 568、1 487個菌株基因信息，是河道污泥中的主要菌種(圖1白點)。

圖1 基于屬、種水平的主要菌群分析

2.2 ZEN去除菌種的篩選和鑒定分析

根據2.1的分析結果，設計和配制樣品中主要微生物菌種的篩選培養基(MRS、NA、 LB)，取10個樣點的樣品分別在固體培養基上用不同的培養方式初篩，篩選到47個菌落形態不同的優勢菌株。所篩菌株在不同初篩培養基上均能較好生長，大部分菌落符合細菌的菌落特征。但在不同培養基和培養方式中，菌落形態差異較大。在MRS培養基上篩選到具有典型乳酸菌菌落特征的多個菌種，在NA培養基上篩選到具有桿菌屬細菌特性的多個菌種，在LB培養基上篩選到具有芽孢桿菌菌落特征的多個菌種。挑取培養基上典型菌落進行革蘭氏染色結果如圖2所示。革蘭氏染色結果顯示，所篩菌種絕大部分為革蘭氏陽性菌，桿狀、球狀和梭狀形態為主，由于培養時間較短，菌體未見明顯芽孢。

注：a為MRS培養基所篩典型菌種，b為NA培養基所篩典型菌種，c為LB培養基所篩典型菌種。

對在不同培養基和培養方式下所篩47株菌種中選代表性菌株25株，采用細菌16SrDNA通用引物擴增菌種的保守序列，結果如圖3所示。所選菌種均能擴增出約1 500 bp的保守序列。對擴增產物進行測序并在NCBI Blast N中進行比對發現，MRS培養基厭氧條件所篩菌種與植物乳桿菌菌株(MG551233.1)的相似度達99%以上，MRS培養基好氧條件所篩菌種與乳酸片球菌菌株(KY550661.1)的相似度達98%以上；NA培養基厭氧條件所篩菌種與糞腸球菌菌株(CP028727.1)的相似度達98%以上，NA培養基好氧條件所篩菌種與海洋芽孢桿菌(KV392046.1)的相似度達98%以上；LB培養基好氧條件所篩菌種與枯草芽孢桿菌菌株(KC422328.1)相似度達到99%以上，LB培養基厭氧條件所篩菌種與巨大芽孢桿菌菌株(CM003163.1)相似度達到97%以上。可初步判斷不同篩選方式所篩菌株分屬不同的微生物品種。所篩菌種的菌體形態及分子鑒定分析與基因組測序分析結果相符。

注：M為DNA marker，大小依次2 000, 1 000, 750, 500, 250, 100 bp，1～9為MRS培養基所篩微生物菌種，10～17為NA培養基所篩微生物菌種，18～25為LB培養基所篩菌種。

2.3 不同樣點菌種對ZEN的去除率

對初篩的47種菌株挑取菌落于相應的液體發酵培養基進行培養，觀察不同編號菌種的菌液變化情況，并在培養18 h后測定發酵液中ZEN的含量，計算培養液中ZEN去除率，結果如表1所示。在10個河道污泥樣品中用3種培養基均篩選到了能夠去除ZEN的微生物菌種。通過對培養基中ZEN含量的測定和統計計算，所篩微生物菌種對ZEN的去除率大部分都在60%以上。說明可去除ZEN的菌種廣泛存在于洛河污泥中。

表1 不同來源樣品菌種對ZEN的去除統計

2.4 不同培養方式所篩菌株對ZEN去除率

按照培養基和培養方式對47株微生物ZEN的去除率進行統計計算，結果如表2所示。LB培養基共篩選到8株去除ZEN的微生物，其中，好氧方式篩選到5株，平均去除率為79.25%，厭氧方式篩選到3株，平均去除率接近70%；NA培養基共篩選到20株去除ZEN的微生物其中好氧方式篩選到9株，平均去除率為80.65%，厭氧方式篩選到11株，平均去除率為55.82%；MRS培養基共篩選到19株去除ZEN的微生物，其中好氧方式篩選到9株，平均去除率為73.43%，厭氧方式篩選到10株，平均去除率為56.49%；3種培養基在好氧培養方式下所篩菌種的去除率顯著高于厭氧培養方式所篩菌種的去除率(P<0.05)。在好氧培養方式下LB、NA培養基所篩菌種的平均去除率差異不顯著(P<0.05)，但顯著高于MRS培養基所篩菌種的平均去除率；在厭氧培養方式下NA、MRS培養基所篩菌種的平均去除率差異不顯著(P<0.05)，但顯著低于LB培養基所篩菌種的平均去除率(P<0.05)。說明好氧篩選和培養方式更適合ZEN去除菌種；LB、NA培養基更有機會篩選到ZEN去除率高的去除菌種。

表2 不同培養方式菌種對ZEN的去除統計

3 討論

ZEN為鐮刀菌屬霉菌產生的一種真菌毒素，廣泛存在于霉變的玉米、小麥等谷物中。而能夠降解ZEN的微生物也廣泛存在于自然環境中。已有的報道成功的從玉米田、沼氣污泥、河道污泥等多種自然環境中篩選到降解ZEN的細菌[16,17]。本實驗從洛河污泥中篩選到了大量能夠降解ZEN的微生物菌種，也驗證了這一點。在篩選策略方面，大部分的成功經驗是以ZEN為唯一碳源，篩選能夠利用ZEN作為營養物質的微生物菌種[16,17]。本實驗首先對污泥樣品中的微生物種群結構進行生物信息學分析，初步查明了污泥樣品中的微生物種群信息后，利用改良篩選培養基有針對性的從污泥樣品的優勢菌群中篩選能夠去除ZEN的微生物菌種。

對已知具有降解ZEN能力的微生物菌種進行鑒定，這些微生物的種類非常豐富，大部分為細菌的芽孢桿菌屬[15,18,19]，主要與芽孢桿菌具有豐富的酶系和很強的環境適應性有關。也有篩選到降解ZEN的假單胞菌的報道[17]。而在霉菌菌種的報道方面，杜穩等[20]在酸性環境下篩選到了降解ZEN的黑曲霉，Liu等[12]研究了益生菌和米曲霉細胞抽提物對ZEN具有降解作用，并且對豬的生產具有明顯緩解中毒癥狀的作用。本實驗通過對樣品中微生物種群分析，其中大部分為芽孢桿菌屬，實驗所篩選到47株去除ZEN的微生物，經形態學和分子鑒定大部分為枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌、巨大芽孢桿菌、海洋芽孢桿菌、乳酸片球菌和糞腸球菌等細菌菌種；但本實驗沒有篩選到與霉菌形態相符的菌種，可能與篩選樣品有關，本實驗所用樣品為河道污泥，有機質含量低，不易發霉，不利于霉菌滋生。

所篩菌種對ZEN的去除能力由于菌種的不同導致去除率變動范圍很大，同時，降解率也與降解底物ZEN的濃度和存在狀態有關，降解菌的降解率從20%多到90%以上的均有報道[17-20]，降解率較高的菌株大多為芽孢桿菌類。本實驗所篩菌種對培養基中5 μg/mL濃度的ZEN去除能力最高的平均去除率達到80%多，個別菌株的去除率達到95%左右，對ZEN去除率較高的菌株大部分屬于芽孢桿菌。而本實驗樣品中的另一個主要菌群乳酸菌類，包括植物乳桿菌、乳酸片球菌和糞腸球菌，在被報道的降解菌中很少見，本實驗中MRS厭氧篩選的菌種平均去除率也最低，可能是因為乳酸菌更多通過對霉菌生長的抑制來抑制真菌毒素的形成，或借助乳酸菌細胞壁與真菌毒素的物理結合來清除毒素[21]。

4 結論

洛河河道污泥中微生物菌群豐富，宏基因組物種分析結果顯示在屬的水平主要是芽孢桿菌屬和乳桿菌屬，在種的水平主要是枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、達蒙海洋桿菌和植物乳桿菌。

能夠降解ZEN的微生物菌種廣泛存在，通過改良MRS、NA和LB培養基一次篩選出47株菌種，均能夠去除培養基中的ZEN。經鑒定所篩菌種大部分為植物乳桿菌、乳酸片球菌、糞腸球菌、海洋芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌等微生物菌種。

所篩選的ZEN去除菌種中，以LB、NA培養基好氧培養方式篩選的對ZEN去除率較高，說明此種方式更可能從河道污泥中篩選到對ZEN去除率高的微生物菌種。