酶處理對初榨橄欖油品質及抗氧化活性的影響

黃 帥 蔣 瑞 王 強 黃梅桂

(南京林業大學輕工與食品學院食品科學與工程系1，南京 210037)(重慶第二師范學院生物與化學工程學院2，重慶 400067)

近年來，將創新提取技術應用于橄欖油的萃取中從而提高橄欖油的品質或產量已成為國內外研究的熱點，這類技術主要包括在橄欖油提取過程中使用微波、超聲波、熱交換技術[8-10]或者在橄欖果糊攪拌融合的過程中加入滑石粉或者酶制劑來提高橄欖油的產量和質量[11, 12]。酶解法由于其高特異性和低操作溫度，在橄欖油提取工業中具有較高的應用價值。在橄欖融合的過程中，酶制劑的加入可以破壞植物的細胞結構，并從細胞中釋放出油脂和水。植物細胞壁主要由果膠物質、纖維素、半纖維素和木質素構成。酶能減少親水酚與多糖的絡合，增加橄欖糊中游離酚的濃度，并在加工過程中釋放到油和廢水中。然而，由于酚類物質的親水性，大量的酚類物質可能會溶解在廢水中，因此，總酚的變化可能與橄欖的品種有關[12]。此外，酶制劑對含有油滴的橄欖糊狀膠體系統也有類似的作用(如果膠、纖維素、蛋白質等)。因此，在橄欖糊融合的過程中加入酶制劑有助于提高出油率并且提升橄欖油的品質。

目前已有研究證明在橄欖融合過程中加入酶制劑可以顯著提高橄欖油的出油率[13, 14]，然而關于添加酶制劑對橄欖油脂肪酸組成、總酚及抗氧化活性影響的研究較為少見。另一方面，在橄欖提取過程中酶制劑的添加量對橄欖油品質的影響是巨大的，確定合適的酶添加量是獲得高品質橄欖油的關鍵。因此，本研究選用重慶地區產量較穩定的豆果品種，在橄欖融合過程中加入不同劑量的酶，研究酶處理前后橄欖油質量指標、化學組分以及抗氧化活性的變化，結合相關性分析和主成分分析，確定最優的酶種類和添加量，以期為國內橄欖油的加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

油橄欖鮮果采集于重慶市合川區油橄欖種植基地，選取產量較穩定的豆果品種在油橄欖成熟初期(果皮全綠)進行手工采摘。采后24 h內提取橄欖油。

果膠酶：10 000 U/g、纖維素酶：30 000 U/g。

1.2 儀器與設備

Aglient7890A氣相色譜；HP-88(100 m×0.25 mm)毛細管色譜柱；TGL-18MS高速離心機；SpectraMax i3x酶標儀。

1.3 橄欖油提取

參照Najafian等[14]的方法，橄欖油的提取步驟：1)清洗，去枝葉；2)用破碎機將橄欖粉碎獲得精細的糊狀物；3)將橄欖糊放入水浴中調節溫度至37 ℃，并按0%、0.2%、0.5%、0.8%的添加量加入果膠酶和纖維素酶；4)使用攪拌機在150 r/min下緩慢攪拌橄欖糊45 min；5)6 000 r/min下離心20 min獲得橄欖油；6)靜置沉淀以獲得清澈的橄欖油。收集到的橄欖油在4 ℃下避光保存。

1.4 質量指標分析

參照ISO 660—2009、ISO 3960—2001和ISO 3656—2002的方法測定橄欖油的游離酸度、過氧化值和特定波長紫外吸收(K232和K270)。

1.5 脂肪酸組成

參照GB 5009.168—2016的方法對橄欖油脂肪酸組成進行測定。

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1.6 酚類化合物的提取

酚類化合物的提取參照Xiang等[15]的方法，稍作改動，5 g橄欖油與10 mL 80% 甲醇混合，振搖1 min后4 000 r/min離心15 min，收集上層液體，重復提取三次后在40 ℃下濃縮并用80%甲醇定容至25 mL。

1.7 總酚含量的測定

通過福林酚法測定總酚含量[15]，20 μL福林酚試劑和20 μL水加入20 μL多酚提取液中，6 min后加入140 μL 10%碳酸鈉溶液，搖勻，避光反應2 h后于760 nm下測定吸光度。結果以每千克油中沒食子酸的含量表示(mg GAE/kg)。

1.8 總抗氧化活性的測定

1.8.1 ABTS自由基清除活性

參照Bouarroudj等[16]的方法測定ABTS自由基清除活性并稍作修改，將ABTS溶液(7 mmol/L)與過硫酸鉀溶液(2.45 mmol/L)按1∶1混合并在室溫下避光保存12～16 h以產生ABTS·+儲備溶液，將ABTS·+儲備溶液用乙醇稀釋至734 nm處吸光度為0.70±0.02。將180 μL稀釋后的ABTS·+儲備溶液與20 μL酚類提取物混合，在10 min后測定734 nm處的吸光度。結果以每千克油中含有Trolox物質的量表示(μmol TE/kg)。

1.8.2 DPPH自由基清除活性

參照Angelica 等[17]的方法測定DPPH自由基清除活性并稍作修改，將180 μL DPPH乙醇溶液(0.2 mmol/L)與20 μL酚類提取物混合，30 min后在517 nm下測量吸光度。結果以每千克油中含有Trolox物質的量表示(μmol TE/kg)。

1.8.3 鐵離子還原能力測定

參考Benzie等[18]的方法測定鐵離子還原能力(Ferric Reducing Antioxidant Power, FRAP)。FRAP試劑是由乙酸鈉緩沖液(pH 3.6)、TPTZ(10 mmol/L)和FeCl3·6H2O溶液(20 mmol/L)按10∶1∶1的比例混合而成。隨后將20 μL 酚類提取液與180 μL FRAP試劑混合。37 ℃下反應30 min并于593 nm處測定吸光度。結果以每千克油中含有Trolox物質的量表示(μmol TE/kg)。

1.9 數據分析

所有結果均以平均值±標準偏差(SD)表示，顯著性分析采用單因素方差分析(ANOVA),并進行Turkey檢驗比較平均值，根據質量指標、脂肪酸組成、總酚及總抗氧化活性，應用主成分分析(Principal component analysis，PCA)和相關性分析(Correlation analysis，CA)深入研究酶處理對橄欖油品質的影響以及各指標間的相關性。所有數據分析均采用SPSS 19.0。

2 結果與討論

2.1 質量指標

橄欖油的游離酸度代表油脂中游離脂肪酸的含量，按油酸的百分比來計算，是評價橄欖油品質的重要指標之一，同時也是橄欖油分類的主要標準之一[16]。如圖1a所示，所有橄欖油樣品的游離酸度均在國際橄欖油理事會(International Olive Oil Council, IOOC, 2003)確定的0.8的上限內。酶在破壞細胞壁的同時會釋放出游離脂肪酸，加入果膠酶和纖維素酶后游離酸度出現明顯的升高，此外，由于果膠酶對細胞壁的降解作用較大，在降解細胞壁的同時能釋放出更多的游離脂肪酸，因此，纖維素酶處理后橄欖油的游離酸度總體低于果膠酶處理后的橄欖油。過氧化值和特定波長紫外吸收(K232和K270)主要用于評估橄欖油的氧化狀態。過氧化值代表油脂中初級氧化產物的含量，結果以每千克油中活性氧的量表示。K232和K270代表著油脂中共軛二烯、共軛三烯以及羰基化合物的含量[15]，如圖1所示，所有橄欖油的過氧化值、K232和K270均在IOOC(2003)規定的范

注：添加酶種類相同時，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圍內(過氧化值：≤20 mmol/kg；K232：≤2.50；K270：≤0.20)[16]。兩種酶處理后，橄欖油的過氧化值都出現下降的趨勢，當纖維素酶的添加量增加到0.8%時，橄欖油的過氧化值上升至11.75 mmol/kg，顯著低于未添加酶時獲得橄欖油的過氧化值(P<0.05)。加酶后K232也同樣表現出下降的趨勢，當兩種酶的添加量增加到0.8%時，K232開始上升。此外，加入纖維素酶后K270未出現明顯的變化。結果表明，在融合過程中添加果膠酶和纖維素酶能有效保護橄欖油不受氧化，顯著降低油中初級氧化產物和次級氧化產物。

2.2 脂肪酸組成

橄欖油的脂肪酸組成主要包括棕櫚酸(C16∶0)，油酸(C18∶1)和亞油酸(C18∶2)，以及少量的棕櫚油酸(C16∶1)，硬脂酸(C18∶0)和亞麻酸(C18∶3)。表1列出了加酶前后橄欖油脂肪酸組成的變化，如表1所示，油酸是橄欖油中主要的脂肪酸，具有抗氧化和降血脂的作用，并且可以預防心血管疾病。酶在降解細胞壁時釋放出大量的游離脂肪酸，因此，在融合過程中加入果膠酶和纖維素酶可以顯著提高橄欖油中的油酸比例(P<0.05)，在加入0.2%纖維素酶和果膠酶后，油酸比例分別提升至65.85%和64.69%，并且隨著兩種酶添加量的增加，油酸的比例逐漸降低。棕櫚酸是橄欖油中主要的飽和脂肪酸，添加纖維素酶和果膠酶后，棕櫚酸的含量顯著降低(P<0.05)，在纖維素酶添加量為0.2%時，棕櫚酸的比例最低，為16.40%，隨著兩種酶添加量的增加，棕櫚酸的比例也略有上升。亞油酸和亞麻酸是橄欖油中omega-6和omega-3族脂肪酸。經兩種酶處理后，亞油酸比例沒有明顯的變化，而亞麻酸的比例隨著酶添加量的增加顯著提升(P<0.05)。

表1 橄欖油樣品的脂肪酸組成

2.3 總酚、總抗氧化活性及相關性分析

橄欖油中的酚類物質是評估橄欖油品質的重要指標，酚類物質可以提高橄欖油的抗氧化性，并與橄欖油的苦味有關，橄欖油中酚類物質含量越高，苦味越強烈[19, 20]。酶處理前后總酚含量的變化如圖2a所示，當加入0.2%纖維素酶后，橄欖油的總酚含量略有下降，隨著纖維素酶添加量的增加，橄欖油的總酚含量也逐漸增加，并在添加量為0.5%時達到最高值(139.95 mg GAE/kg)。添加0.2%果膠酶后，橄欖油中總酚含量略有上升，但并不顯著(P>0.05)。隨著果膠酶添加量增加至0.5%和0.8%，總酚含量出現顯著提升(P<0.05)，分別為165.05 mg GAE/kg和155.05 mg GAE/kg。這是由于果膠酶和纖維素酶能有效降解橄欖細胞壁，從而提高了酚類化合物的提取。此外，酶的存在能夠降低橄欖糊中多糖與酚類之間的相互作用，這種相互作用會形成能夠包埋多酚化合物的復合物，被認為是果糊破碎融合過程中酚類物質損失的主要原因之一。另一方面，這種機制誘導了乳液的形成，其穩定性取決于從橄欖和水中轉移到橄欖油中的內源性兩親物(如磷脂、糖、蛋白質等)。乳液的穩定性對于橄欖油的質量(包括酚類化合物)至關重要[21]。

酶處理前后橄欖油樣品的抗氧化活性如圖2所示，ABTS和DPPH主要用于評估化合物的自由基清除活性，而FRAP主要用于確定樣品的鐵離子還原能力。添加0.2%和0.8%纖維素酶后，橄欖油的ABTS抗氧化活性未出現顯著變化，當纖維素酶添加量為0.5%時，ABTS抗氧化活性達到616.85 μmol TE/kg，顯著高于其他樣品(P<0.05)。橄欖油的ABTS抗氧化活性在果膠酶添加量為0.5%時最高，為515.14 μmol TE/kg。當果膠酶的添加量增加至0.8%，ABTS抗氧化活性未出現顯著變化(P<0.05)。DPPH抗氧化活性在纖維素酶和果膠酶添加量為0.5%時最高，分別為532.40、479.60 μmol TE/kg。當加入0.2%纖維素酶時，橄欖油的總酚和DPPH抗氧化活性都出現下降的趨勢，這是由于當加酶量較低時，絡合在纖維素等結構中的不可提取部分酚并未得到釋放，橄欖糊中游離酚的濃度增加較少，并且由于酶釋放出了細胞中的水分，使得大量的親水酚溶于廢水中，因此，加入少量酶會降低總酚及DPPH抗氧化活性[6]。

注：添加酶種類相同時，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

FRAP的變化趨勢與ABTS抗氧化活性相似，在兩種酶添加量0.5%時，鐵離子還原能力達到最大。事實上，當兩種酶的添加量為0.5%時，橄欖油總酚含量與總抗氧化活性都達到最大，且總酚與總抗氧化活性呈高度相關。表2列出了各指標之間的相關性，如表2所示，總酚含量與ABTS、DPPH和FRAP呈高度相關(相關系數r分別為0.601、0.814和0.829)，并與DPPH和FRAP相關性顯著(P<0.05)。而ABTS與DPPH和FRAP之間相關性呈極顯著(P<0.01)，相關系數r分別為0.918和0.928，FRAP與DPPH之間也呈極顯著相關(P<0.01)，相關系數r為0.947。此外，過氧化值與K232呈顯著正相關(P<0.05)而與三種抗氧化活性之間呈高度的負相關，并與FRAP之間呈極顯著負相關，相關系數r為-0.895。本研究的結果證明了果膠酶和纖維素酶能有效降低橄欖油中的氧化產物，并提高油脂的抗氧化能力。

表2 橄欖油質量指標、化學組成及抗氧化活性的相關性分析

2.4 主成分分析

主成分分析(PCA)是一種無監督的多元分析方法，通過降低原始數據矩陣的維數對數據進行分析。數據中提取的主成分可研究酶處理對橄欖油品質的影響，并確定哪些變量是造成差異的主要原因[22]。本研究根據油脂的質量指標、脂肪酸組成、總酚和總抗氧化活性，對酶處理前后橄欖油品質的變化進行深入分析，并對其進行分類，根據主成分綜合得分計算最優的酶及添加量。主成分分析的結果如圖3所示，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的累計貢獻率為71.79%。其中，PC1的方差貢獻率為51.38%，與亞油酸含量、油酸含量、亞麻酸含量、總酚以及總抗氧化活性呈正相關，與過氧化值和K232呈負相關。PC2的方差貢獻率為20.41%，與亞油酸含量、總酚以及總抗氧化活性呈正相關，與油酸含量呈負相關。總酚、總抗氧化活性以及橄欖油氧化指標在PC1中占有較大比重，而油酸、亞油酸的含量在PC2中占有較大比重，因此，結合PC1和PC2可以更清晰的研究酶處理前后橄欖油的品質變化。如圖3b所示，所有橄欖油樣品可分為三類，未添加酶的橄欖油樣品與加酶處理后的橄欖油樣品在PC1和PC2方向上均相差較大。添加0.5%纖維素酶的橄欖油樣品的總酚及抗氧化活性最高，因此其PC1得分遠大于其他樣品。此外，由于添加0.5%纖維素酶得到的橄欖油過氧化值和K232較低，因此添加0.5%纖維素酶能有效提高橄欖油的總酚、抗氧化活性和氧化穩定性。

注：A：未添加酶；C1：添加0.2%纖維素酶；C2：添加0.5%纖維素酶；C3：添加0.8%纖維素酶；P1：添加0.2%果膠酶；P2：添加0.5%果膠酶；P3：添加0.8%果膠酶)。

3 結論

本研究選用重慶地區產量較穩定的豆果品種，在橄欖融合過程中加入不同劑量的酶，研究酶處理前后橄欖油質量指標、脂肪酸組成、總酚以及抗氧化活性的變化。結果表明，酶處理可以有效降低橄欖油中的氧化產物，并增加橄欖油中油酸的比例。雖然酶處理后的橄欖油游離脂肪酸的含量會有小幅提升，但是所有橄欖油樣品的游離酸度均在IOOC(2003)所規定的范圍內。此外，果膠酶和纖維素酶能有效降解橄欖細胞壁，減少親水酚類物質與細胞壁多糖的絡合，有助于橄欖果皮中的游離酚的釋放，從而提高橄欖油中總酚含量及抗氧化活性。結合主成分分析的結果，確定了在橄欖融合的過程中添加0.5%纖維素酶得到的橄欖油總酚、抗氧化活性和氧化穩定性最高。