不同加工方式的鐵核桃油對HepG2細胞膽固醇合成的影響及機制初探

高 盼 劉睿杰 王興國

(武漢輕工大學食品科學與工程學院1，武漢 430023)(大宗糧油精深加工教育部重點實驗室；武漢輕工大學2，武漢 430023)(江南大學食品學院3,無錫 214122)

鐵核桃是我國獨有的核桃種類，主要生長于我國高海拔的西南部地區。鐵核桃是常綠喬木，樹體高大，抗寒抗病性優越，產量也較高，是良好的生態型經濟樹種[1]。由于鐵核桃極易存活，多長于野外，不占用耕地等優良性能，近幾年在我國云南、西藏等地被大量種植，是當地重要的經濟林業作物，鐵核桃在我國核桃資源的占比逐年增加，現已成為我國兩大主要核桃種類之一。鐵核桃是我國獨有的核桃油原料，由于其種植成本較低，深受核桃油生產企業的歡迎，但鐵核桃油的相關研究很少[2，3]，其功能特性尚不清楚。

加工方式是影響核桃油組成特性的主要因素之一，油脂的品質強烈地依賴于所使用的加工方法[4]，通過不同方法提取的堅果油品質特性有所差異[5]，為了獲得營養價值更高的核桃油，必須采用適當的加工方法。低溫壓榨是一種傳統的提取堅果油的方法，已廣泛用于制取杏仁油、南瓜子油和松子油中，也是最為常見的核桃油制取方法[6]。焙烤壓榨能增強風味[7]，作為一種加工前處理方式也廣泛用于種子或果仁的食用油制備，但除了Vaidya和Eun[8]報道了焙烤壓榨-正己烷浸出對薄皮核桃油理化特性和氧化穩定性的研究以外，焙烤壓榨較少應用于核桃油中。溶劑浸出常用于堅果油的工業萃取，因為這種加工方式可以提高油的產率[9]，易于蒸發且成本較低。目前實驗室和工業上使用的主流溶劑是正己烷[10]。亞臨界丁烷萃取與傳統的加工方法相比，具有安全、高效、成本低廉的優點，在低溫下可通過系統減壓完全除去丁烷，萃取后的丁烷可完全回收[11]。超臨界二氧化碳萃取是近年來發展起來的一種新型制油方法，它不會造成萃取組分的熱降解，也不會導致萃取物中殘留溶劑[12]。這五種加工方式都具有極好的實用性，適合用來加工核桃油。

核桃油作為營養油，其營養價值備受關注，但目前鮮見鐵核桃油營養研究報道。受中國傳統觀念的影響，對核桃油營養價值的期待是具有健腦功效。研究發現，健腦與膽固醇代謝密切相關，通過對阿爾茨海默癥(AD)患者的尸檢報告[13]研究發現，有90%左右的AD患者生前同樣患有動脈粥樣硬化等心血管疾病；有臨床研究證實[14]，他汀類藥物可以通過降低膽固醇水平抑制癡呆的進一步發展；更有大量的研究[15，16]證明，膽固醇代謝的相關基因，在AD中也具有顯著的影響。因此，認為膽固醇代謝在AD的發病機制中可能起到了重要的作用[17]。同時核桃油對動脈粥樣硬化的作用存在爭議[18-20]，膽固醇積累是動脈粥樣硬化的根本原因，研究核桃油對膽固醇代謝的作用是研究核桃油抗動脈粥樣硬化的基礎。因此，探索核桃油對膽固醇代謝的作用，對核桃油營養功效的評估極為重要。膽固醇合成途徑如圖1所示。

圖1 膽固醇合成途徑

膽固醇的合成受到了多種酶和蛋白的綜合調控。SREBP-2位于內質網上，具有較長的轉錄激活域，是一種調節膽固醇合成的轉錄因子。SREBP-2可以通過調節轉錄機制來調節膽固醇合成[22]。HMGCR也存在于細胞的內質網內，是膽固醇合成的限速酶，能決定膽固醇合成的快慢與程度，是SREBP-2下游的重要調控因子。HMGCR抑制劑是一種被廣泛使用的降膽固醇他汀類藥物[23]。CYP51屬于細胞色素P450家族，是膽固醇合成過程中催化羊毛甾醇轉化成膽固醇的作用酶，參與膽固醇合成的最后一步[24]。

HepG2細胞作為人肝癌細胞株能夠表達參與膽固醇代謝相關的酶和蛋白，極其適用于模擬人體正常肝臟細胞，是合適的膽固醇代謝模型細胞系。本實驗以不同加工方式的鐵核桃油為原料，誘導HepG2細胞構建膽固醇評價模型，檢測膽固醇合成關鍵基因的表達，探索鐵核桃油對膽固醇合成的功效及作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鐵核桃采自新疆維吾爾自治區的漾泡鐵核桃大型商業種植園，于當年8—9月采摘，經過脫青皮和清洗處理后，立刻運送至實驗室，在45 ℃下恒溫干燥3 d，使核桃含水量降至6%～8%。鐵核桃樣品保存在-80 ℃的冷庫中，核桃油采用密封性好的深色容器放置于-20 ℃中，直至樣品檢測。

1.2 實驗試劑

HepG2細胞系、DMEM培養基(Gibco)、胎牛血清(Gibco)、青霉素-鏈霉素(Gibco)、PBS(Hyclone)、胰蛋白酶、二甲亞砜(DMSO)。

總膽固醇試劑盒、RNAeasyTM動物RNA抽提試劑盒(離心柱式)、反轉錄試劑盒Fast Quant RT Kit(gDNase)、iTaqTMSYBR?Green SuperMix。

1.3 實驗儀器與設備

R510旋轉蒸發器，t25均質機，CBE-5L亞臨界流體萃取實驗室成套設備，超臨界CO2流體萃取裝置，HFG 50S WN螺旋壓榨機，Forma 310二氧化碳恒溫培養箱，NanoDrop-one微量紫外分光光度計，T100 PCR擴增儀，CFX-Connect實時熒光定量PCR儀，GelDoxXR+凝膠成像儀。

1.4 脂質提取

由于鐵核桃外殼堅硬，使用錘子和液壓機破殼，后人工分離核桃仁。

低溫壓榨：稱取核桃仁，使用HFG 50S WN螺旋壓榨機在室溫下進行壓榨，選取的壓榨孔徑為6 mm，螺桿速度為20 r/min，壓榨溫度為(60±10) ℃，收集的油溫度為(40±2) ℃。

焙烤壓榨：稱取核桃仁，放入烘箱中焙烤，根據不同焙烤時間和焙烤溫度的比較，最終選擇160 ℃焙烤15 min，焙烤后核桃仁放入干燥器中冷卻，將冷卻后的焙烤核桃仁按低溫壓榨工藝制油。

浸出：稱取核桃仁并研磨成細粉，以正己烷為提取溶劑，核桃仁和溶劑按1∶5混合，然后使用均質機以7 500 r/min的速度均質5 min，再使用布氏漏斗過濾混合物。用相同體積的溶劑對殘余物進行兩次再萃取，并將三次萃取的濾液合并。在真空條件下，通過真空控制使用旋轉蒸發器釋放溶劑，直到沒有溶劑蒸發。旋轉蒸發后，用氮氣去除可能殘留的溶劑。

亞臨界：稱取核桃仁，核桃仁與丁烷的提取比例為1∶5，使用亞臨界設備進行亞臨界丁烷萃取，實驗溫度為40 ℃，壓力為0.5 MPa，反應時間為2 h。

超臨界：稱取核桃仁，將核桃仁放入2 L的提取容器中，使用超臨界萃取系統，在35 MPa真空壓力下提取1 h，以99.999%純度的CO2注入超臨界萃取裝置，流速為0.5 L/min，熱交換器的溫度設定為50 ℃，分離器的溫度和壓力分別為40 ℃和9 MPa。

收集的核桃毛油進行離心去除雜質，離心轉速為5 000 r/min，時間20 min，離心后，得到澄清的核桃油。將核桃油放置于棕色樣品瓶中，放置于4 ℃冰箱避光儲存。

1.5 HepG2細胞培養

根據按照美國標準培養物收藏所(American Type Culture Collection，ATCC)的標準方法，取對數期生長狀態良好的HepG2細胞，將0.5×106個細胞接種于6 cm的培養皿中，加入89% DMEM+10%FBS+1%青霉素-鏈霉素的培養基，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。當細胞密度達到70%～80%時，準備給藥，給藥培養基為99% DMEM+1%青霉素-鏈霉素。

1.6 HepG2細胞毒性檢測

根據Wolfe等[25]實驗方法進行條件優化，采用亞甲基藍染色法測定不同濃度的核桃油對HepG2細胞存活率的影響。取對數生長期的HepG2細胞，將細胞接種于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養24 h。將核桃油溶解于DMSO中，配制成不同濃度的核桃油-DMSO溶液。另外增設調零組(不含細胞和樣品)、空白對照組(含有細胞但不含樣品)，和陽性對照組(含有細胞和千分之一的DMSO)。置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養24 h后，加入亞甲基藍染色液(98%HBSS+0.67%戊二醛+亞甲基藍)。37 ℃孵育1 h后去除染色液，充分洗滌后加入洗脫液(49% PBS+50%乙醇+1%乙酸)，搖床低速振蕩20 min，使染色液充分溶解，酶標儀檢測OD570 nm處各孔的吸光值。以DMEM培養液調零組調零，空白對照組作為對照，計算HepG2細胞活力，選取處理HepG2細胞的最佳核桃油-DMSO濃度。

1.7 總膽固醇的測定

將HepG2細胞處理后，細胞分為對照組和實驗組。對照組添加DMSO，實驗組添加最佳濃度的核桃油-DMSO溶液。培養48 h，加入150 μL RIPA裂解液使細胞完全破碎，根據TC的試劑盒使用方法進行檢測。

1.8 q-PCR檢測

采用RNA抽提試劑盒提取總RNA，檢測RNA的純度和完整性后，使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄合成第一鏈cDNA，以反轉錄合成的單鏈cDNA為模板，選取適當濃度，配制實時熒光定量PCR反應體系，置于PCR擴增儀進行擴增檢測，其擴增反應條件為：95 ℃/2 min；95 ℃/5 s，60 ℃/30 s，(40個循環)；72 ℃/5 min。反應結束后，根據繪制的標準曲線，選取斜率在2左右，CT值在20～30之間對應的濃度作為后續檢測的cDNA反應濃度。使用GAPDH作為對照基因，每個樣品重復三次，以2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。引物序列詳見表1。

表1 引物序列表

1.9 數據處理與分析

所有實驗至少重復3次以上，核桃油組成特性的數據以mean±SD表示。采用SPSS 23.0軟件進行數據分析，使用Tukey′s-b檢驗對所有參數進行評價，ANOVA實驗的統計學差異在5%水平顯著(P<0.05)。

2 結果

2.1 鐵核桃油對HepG2細胞活力的影響

采用亞甲基藍染色法測定細胞存活率，其檢測原理是亞甲基藍可以結合核酸，使活細胞的細胞核呈藍色。本實驗使用亞甲基藍染色法評估核桃油對HepG2細胞活力的影響，以不加樣品的細胞作為對照，以只加DMSO的細胞作為陽性對照，研究核桃油的細胞毒性，以確定最佳的核桃油細胞添加量。不同濃度核桃油添加量對細胞活力的影響如圖2所示。當DMSO的添加量為0.50%時，細胞活力為83.32%(<90%)，具有細胞毒性，而當DMSO添加量為0.10%時，細胞活力為105.31%，選擇0.1%作為DMSO的細胞添加量。

注：*表示P<0.05，余同。

通過比較不同終濃度的核桃油添加量發現，當核桃油添加量為1 000 μg/mL時，其細胞活力具有明顯的抑制作用，顯著低于其他添加濃度的細胞活力，而核桃油添加量為500 μg/mL時，細胞活力為112.74%，顯著高于空白對照組及DMSO陽性對照組，同時繼續減少核桃油的添加量對細胞活力的影響不大，因此，選擇500 μg/mL作為核桃油的添加量。

2.2 鐵核桃油對HepG2細胞TC含量的影響

圖3顯示了不同加工方式的鐵核桃油對HepG2細胞TC的影響。從圖3可以看出，與對照組相比，所有鐵核桃油都能顯著降低HepG2細胞的TC含量(P<0.05)，其中低溫壓榨鐵核桃油的TC降低極為顯著，下降了52.36%，而其他加工方式的樣品間無顯著性差異(P>0.05)，大約降低了35.79%～42.60%。

注：字母表示在5%顯著水平的統計差異，余同。

2.3 鐵核桃油對HepG2細胞膽固醇合成基因表達的影響

鐵核桃油對HepG2細胞HMGCR表達的影響如圖4所示。與對照組相比，只有低溫壓榨鐵核桃油和亞臨界鐵核桃油能顯著下調HepG2細胞中HMGCR mRNA的表達量(P<0.05)，分別下調了37.67%和28.00%，而其他加工方式的鐵核桃油與對照組相比，雖然絕對值降低，但無統計學差異(P>0.05)。

圖4 鐵核桃油對HepG2細胞HMGCR表達的影響

圖5顯示了鐵核桃油對HepG2細胞SREBP-2表達的影響。與對照組相比，只有亞臨界加工的鐵核桃油樣品能顯著下調SREBP-2 mRNA的表達量，大約下調了50%，而其他加工方式的鐵核桃油雖然從絕對值上略微下調了SREBP-2基因的表達，但無統計學差異(P>0.05)。

圖5 鐵核桃油對HepG2細胞SREBP-2表達的影響

圖6顯示了鐵核桃油對CYP51基因表達的影響，不同加工方式的鐵核桃油都能顯著降低HepG2細胞中CYP51 mRNA的表達量(P<0.05)，其中亞臨界和正己烷浸出的鐵核桃油對CYP51基因的調節作用最強，分別下調了30.67%和26.33%。

圖6 核桃油對HepG2細胞CYP51表達的影響

3 討論

雖然人體各個組織都可以合成膽固醇，但肝臟是膽固醇合成的主要場所[26]。HepG2細胞作為人肝癌細胞株能夠表達參與膽固醇代謝相關的酶和蛋白，極其適用于模擬人體正常肝臟細胞，是合適的膽固醇代謝模型細胞系。細胞內膽固醇的合成主要分為五個步驟：3-羥基-3-甲基-戊二酸單酰輔酶A(3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A，HMG-CoA)在HMG-CoA還原酶(3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A Reductase，HMGCR)的催化下，生成二羥甲基戊酸；生成的二羥甲基戊酸在酶的催化作用下，異構化生成異戊烯醇焦磷酸酯；異戊烯醇焦磷酸酯在異構酶的作用下生成二甲丙基焦磷酸，之后經過一系列的酶促反應最終聚合生成鯊烯；鯊烯經酶的作用，環化生成羊毛甾醇；羊毛甾醇經氧化、脫羧、還原等反應生成膽固醇[27]。

鐵核桃油誘導HepG2細胞后，下調HMGCR基因的表達，減少膽固醇合成過程中二羥甲基戊酸的含量；由于SREBP-2表達量的下調，從膜中釋放的SREBP N端結構域減少，進入細胞核后，與基因結合減少；合成反應中生成的羊毛甾醇由于其催化酶CYP51表達量的減少，使其轉化成膽固醇的含量也下降，基于HMGCR、SREBP-2和CYP51基因的調控，使膽固醇的合成減少，影響了膽固醇代謝，使TC含量降低，起到了降膽固醇的作用。

Zhang等[28]使用核桃油誘導THP-1巨噬細胞衍生泡沫細胞，也能降低細胞的TC含量，但該研究認為核桃油對膽固醇合成沒有影響，會影響膽固醇的排泄，這與本實驗結果并不一致，造成這種現象的原因可能是選擇的細胞模型不一樣，HepG2細胞作為肝癌細胞主要表達膽固醇在肝臟內合成和轉化相關的基因，而THP-1巨噬細胞衍生泡沫細胞主要表征膽固醇逆轉運和外排相關的表達。

根據對不同加工方式的鐵核桃油組成特性的檢測發現[29](實驗數據見附錄)，不同加工方式的鐵核桃油具有相似的脂肪酸組成和甘油三酯組成，以及差異較大的微量伴隨物含量。因此推測鐵核桃油中引起膽固醇合成功效差異的物質，可能是核桃油中的微量伴隨物。

油脂中微量伴隨物對膽固醇代謝的影響已有報道。程敏[30]發現，相比于精煉椰子油，含有豐富微量伴隨物的初榨椰子油具有更好的降膽固醇功效，但是比較棕櫚油發現，生育酚含量更少的精煉棕櫚油比天然的巴西棕櫚油具有更好的降TC和TG作用[31]，精煉莧菜油與莧菜原油的研究也有相似的結果[32]。造成這種現象的可能原因是微量伴隨物的含量不是越高越好，而是存在一定的量效關系。因此，優選鐵核桃油的加工方式，會影響其降膽固醇的功效，同時，在鐵核桃油的生產過程中，需要更加重視其微量伴隨物的含量，這些微量成分對鐵核桃油的功能特性影響極大。

4 結論

本研究以五種不同加工方式制備的鐵核桃油為原料，檢測了鐵核桃油對HepG2細胞膽固醇合成代謝的影響和作用機制，證明了鐵核桃油能通過調節膽固醇合成基因HMGCR，SREBP-2和CYP51基因的表達，減少HepG2細胞的膽固醇合成，起到降膽固醇的作用。結合不同加工方式鐵核桃油的組成特性結果分析，推測鐵核桃油中的微量伴隨物是影響其膽固醇合成作用的主要物質。