花椒精油對1型糖尿病小鼠腸道健康的影響

任廷遠 陸敏濤 黃 濤 陸龍發 楊 建 秦禮康

(貴州大學釀酒與食品工程學院1，貴陽 550025)(貴州玄德生物科技股份有限公司2，貴陽 550016)(貴州省農業生物工程重點實驗室3，貴陽 550025)(貴州省農業科學院農業部DUS中心貴陽分中心4，貴陽 550006)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim)是蕓香科(Rrutaceac)花椒屬植物的果皮，屬藥食同源類物質[1]?；ń肪陀纸谢ń窊]發油，由花椒果皮所提取分子量較小的揮發性精油類物質，顏色以無色或淺黃色為主，提取過程中可以隨蒸汽蒸出，是花椒的原次生代謝產物，它對花椒獨特的香氣具有很大的貢獻[2]，其不僅是一種重要的食品添加劑和調味料，也可作為醫藥、化妝品和農藥等的基礎原料，具有廣泛的開發利用價[3]。近年來，花椒精油的提取、抗菌活性、成分分析已經成為了研究的熱點。路純明等[4]對花椒揮發油進行純化，獲得各純化組分；并分析這些組份對雜擬谷盜的影響，結果顯示能夠殺滅這種害蟲的成蟲，其中β-水芹烯和芳樟醇有較強的殺蟲活性。聶霄艷等[5]研究發現花椒精油中β-水芹烯既有驅蟲效果，又有觸殺作用。W.Choochote等[6]對比花椒精油與其他植物精油對伊蚊的作用效果，結果顯示花椒精油可以有效驅除伊蚊達到1 h。王峰等[7]對比了超臨界、亞臨界萃取法和水蒸氣蒸餾法提取的花椒精油的抑菌效果，結果表明不同方法提取的花椒精油均有抑菌效果，其作用效果區別不大，且對金黃色葡萄球菌、濃綠桿菌和傷寒沙門氏菌有良好的抑制作用。弭向輝[8]初步研究了花椒精油的抗腫瘤作用，發現花椒精油能抑制黑色素瘤細胞A375的生長，并觀察到黑色素瘤細胞A375體積明顯縮小，呈現不規則生長狀態，且出現了大量細胞破碎的狀況；而且精油的抗瘤細胞作用與其濃度和時間相關。袁太寧等[9]應用花椒精油處理宮頸癌Hela細胞，發現在低濃度的狀態下就可以誘導細胞凋亡。另外，花椒精油抗脂質過氧化活性和清除自由基活性的能力比維生素E、維生素C都更勝一籌，而且抗脂質過氧化作用比清除自由基活性稍強[10]。蔡華珍等[11]采用0.1%八角精油、0.08%花椒精油、0.04%桂皮精油作為保鮮劑能使調理雞肉串在4 ℃下保鮮達20 d, 25 ℃下保鮮16～18 h。

腸道微生態系統是影響動物消化吸收能力的重要因素，腸道菌群平衡有助于提高動物的消化吸收能力[12]。孫琳等[13]研究表明，花椒精油對葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)介導潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis,UC)小鼠的腸道菌群有益的影響。Castillo M等[14]研究表明，在飼糧中添加3%肉桂醛的植物精油，可顯著增加斷奶仔豬腸道內有益菌乳酸桿菌數量，能緩解仔豬斷奶應激作用；Tiihonen K等[15,16]研究表明，飼糧中添加肉桂醛可調節肉雞腸道菌群，維持腸道微生態平衡，從而提高肉雞生長性能。王光富等[17]研究表明，單獨添加植物精油和酸化劑較混合添加有助于維持羅曼粉殼產蛋雞盲腸微生物穩態。Figen等[18]研究表明，大蒜精油和牛至可顯著降低肉雞腸道梭狀芽孢桿菌和鏈球菌數量以上的研究表明，植物精油可抑制腸道有害菌生長，促進有益菌生長，發生改善機體腸道平衡的作用?；ń芳盎ń仿槲段镔|對機體糖代謝[19]、脂代謝[20]、蛋白質代謝[21]及腸道健康[22]的影響及其機制已基本清楚，而花椒精油對機體腸道的影響研究較少，因此研究花椒精油對腸道健康的影響具有重要意義。

采用STZ誘導建立1型糖尿病小鼠模型，分別從生長狀況、理化指標、腸道微環境及腸道微生物等研究花椒精油對1型糖尿病小鼠腸道健康的影響，以期為花椒精油在食品、醫療、功能性食品中的應用提供的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅花椒精油，由陜西韓城產大紅袍花椒，經超臨界CO2萃取后，用分子蒸餾分離而得，由貴州玄德生物科技股份有限公司提供；昆明種雄性小鼠，SPF級，每只18～22 g，共58只，由貴州醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號為SCXK(黔)2018-0001；鏈脲佐菌素(STZ)、DNA凝膠回收試劑盒、糞便DNA提取試劑盒、熒光定量試劑盒、短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、異酸)標準品、巴豆酸、丙氨酸標準品。

1.2 儀器與設備

DW-HL398超低溫冷凍儲存箱、PHS-3E3C精密pH計、S1000 梯度 PCR 儀、氣相色譜儀GC-2010，Staibilwax-DA毛細管色譜柱、L5S紫外-可見光光度計、Nano Drop 1000微量紫外分光光度、Light Cycler Nano 熒光定量 PCR 儀、740血糖儀。

1.3 動物飼養與樣品采集

動物實驗過程嚴格遵循現行的貴州醫科技大學實驗動物倫理委員會批準的相關法律法規進行(SYXK(黔)2018-0001)。將58只SPF級，18～22 g，雄性小鼠適應性喂養1周后，按體質量隨機分為空白組(n=10)和造模組(n=48)，禁食不禁水12 h，造模組(n=48)一次性腹腔注射150 mg/kg STZ造模，空白組腹腔注射等劑量的檸檬酸緩沖液，注射后第3天，禁食10 h，尾尖采血，測量其空腹血糖值，血糖值高于11.10 mmol/L時則造模成功[19-21]，并篩除建模失敗的小鼠。把40只建模成功的小鼠根據隨機區組法按血糖值分為4組(n=10)，模型組0 mg/(kg·d)、高劑量組15 mg/(kg·d)、中劑量組9 mg/(kg·d)和低劑量組3 mg/ (kg·d)。每天上午10:00灌胃，空白對照組和模型組灌胃等劑量的大豆油，實驗期間自由飲食和飲水，每天記錄飲食飲水量。每3 d稱1次小鼠體質量，并調整灌胃量。飼喂28 d后，禁食12 h，眼眶取血后，解剖，取出肝臟、腎、脂肪、肓腸等組織；其中肓腸稱重后，從一端縱切開，訊速將內溶物分裝于滅過菌的1.5 mL試管中，置于液氮中保存；肓腸壁于4 ℃水理鹽水中洗凈，吸水紙吸干后稱重及測量表面積。

1.4 花椒精油的處理

為保證每只小鼠為等劑量灌胃(40 g體重小鼠灌胃0.2 mL劑量)，準確稱取1.2 g紅花椒精油，加入400 mL大豆油后，充分混勻，配制成3 mg/mL花椒精油溶液，分別用大豆油稀釋成1.8、0.6 mg/mL的花椒精油溶液，用于高(15 mg/mL)、中(9 mg/mL)、低(3 mg/mL)劑量組的灌胃濃度，空白組和模型組灌胃等劑量大豆油，每3 d配一次，于4 ℃保存。

1.5 飼料效率計算公式[1,22]

1.6 盲腸壁表面積的測定

參照游玉明等[22]方法進行，將剪切下來的盲腸洗凈后，從一端縱切開，用小刀將其全部展開平鋪在帶有刻度的坐標紙上，用鉛筆沿盲腸壁的邊緣描繪。用剪刀沿線條剪下畫線的部分，并稱重。將稱重結果帶入表面積計算公式，算出盲腸壁面積。

式中：A0為剪下輪廓紙的質量；A為1 cm2的坐標紙的質量。

1.7 血糖值的測定

在給藥后的0、14、28 d，禁食不禁水6 h，使用血糖儀剪尾采血測定FBG[19-21]。

1.8 盲腸內容物pH[23]

稱取0.5 g盲腸內容物于離心管中，加入質量比體積為1∶10的蒸餾水，震蕩2 min；3 500 r/min，離心10 min，取上清液用精密pH計測量其pH。

1.9 盲腸內容物游離氨含量[22,23]

準確稱取丙氨酸標準品10 mg，加入少量蒸餾水溶解后定容至100 mL，得到丙氨酸標準液母液。分別吸取配好的丙氨酸標準母液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于比色管中，加入pH=8.0磷酸鹽緩沖溶液0.5 mL和 2% 茚三酮溶液0.5 mL，再加入蒸餾水至2 mL，于沸水浴中加熱15 min，靜置15 min，用移液槍吸取0.2 mL稀釋至5 mL，于570 nm波長下測定吸光值。根據結果求得回歸方程為y=0.184 4x-0.017 5，相關系數R2=0.990 2。

盲腸內容物經過處理后，分別吸取1 mL至比色管中，加入配好的磷酸緩沖液0.5 mL和2%茚三酮溶液0.5 mL，于沸水浴中加熱15 min，冷卻后吸取0.2 mL稀釋到5 mL，于570 nm波長下測定吸光值。

1.10 盲腸內容物游離脂肪酸的測定

參照李明澤等[22,24]方法進行，稱取0.5 g盲腸內容物加入10 mol/L氫氧化鈉溶液(含有巴豆酸5 mmol/L)2 mL，混勻靜置30 min，在4 ℃，4 000r/min下離心15 min，經0.22 μm微孔濾膜過濾上清液后，用氣相色譜法進行測定。

色譜條件為：Staibilwax-DA毛細管色譜柱(30 m × 0.2 mm, 0.5 μm)；升溫程序：90 ℃保持0.5 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持7 min；進樣量1μL載氣流速0.95 mL/min，進樣口溫度220 ℃，FID檢測器，檢測器溫度230 ℃；氫氣流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min，尾吹流量40 mL/min。

1.11 盲腸內容物微生物檢測

取一份盲腸內容物，按照糞便細菌基因組DNA提取試劑盒的說明提取其中細菌DNA，測定濃度及純度，保存于-20 ℃環境下備用。參照文獻設計各腸道菌群特異性PCR引物[25,26]，在BLAST基因庫內(www.ncbi.nlm.nih.gov)比對引物序列特異性。各引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。其定量測定采用20 μL反應體系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10 μL, 10 μmol/L上下游引物各1 μL，模板2 μL，雙蒸水6 μL。反應條件為：95 ℃條件預變性5 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環，同時進行高分辨率溶解曲線實驗。各基因引物序列及產物長度如表1。

表1 各細菌引物序列及產物長度

1.12 數據處理

本實驗結果以 mean±SD 表示，各組間差異顯著性采用SPSS 16.0 軟件分析，各組間比較采用單因素方差分析，用Duncan法分析顯著性，P<0.05被認為有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 花椒精油

花椒特殊的香味，主要源自花椒皮中貯存的揮發性成分，稱為揮發油或者精油，是花椒香氣的主要組成成分[27]。由圖1可知，韓城紅椒精油顏色為淺黃色，而金陽青椒精油顏色為無色，各自均具有典型的芳香味，兩者均無麻味，但青椒精油苦味明顯大于紅椒精油。本實驗使用的紅花椒精油，由貴州玄德生物科技股份有限公司采用陜西韓城產大紅袍花椒，經超臨界CO2萃取后，用分子蒸餾分離而得。

圖1 花椒精油

2.2 花椒精油對小鼠生長狀況的影響

由表2可知，與空白組相對，模型組體質量增加量和飼料效率顯著(P<0.05)降低，而日均采食量顯著(P<0.05)升高；與模型組相比，花椒精油能顯著(P<0.05)提高小鼠體重增加量和飼料效率，高劑量和中劑量采食量顯著(P<0.05)降低。結果表明，灌胃花椒精油后，采食量減少，但飼料效率有所增加，說明花椒精油能夠促進小鼠對飼料的消化利用率。

表2 花椒精油對小鼠體重、采食量及飼料效率的影響(n=10)

2.3 花椒精油對糖尿病小鼠血糖的影響

由表3可知，飼喂期間空白對照組小鼠空腹血糖始終維持在正常范圍內(4～6 mmol/L)，模型對照組血糖值則大于11.1 mmol/L，說明造模成功且比較穩定。與模型組相比，灌胃花椒精油14 d后，高、中、低劑量組空腹血糖均顯著下降(P<0.05)，其中高劑量組由20.03下降到17.45，下降了12.86%；中劑量組由19.46下降到17.97，下降了7.67%；低劑量由21.07下降到19.55，下降了7.22%。灌胃28 d后，各劑量組血糖進一步下降，與0 d相對，高、中、低劑量組分別下了19.09%、9.12% 和9.56%(P<0.05)。說明花椒精油對糖尿病小鼠具有顯著的降糖效果，其機制有待進一步研究。

表3 花椒精油對糖尿病大鼠血糖的影響 (n=10)

2.4 花椒精油對小鼠盲腸及其微環境的影響

花椒精油對糖尿病小鼠盲腸及其微環境的影響如表4。與空白相比，模型組盲腸總質量、盲腸壁質量和盲腸表面積均顯著(P<0.05)增加，分別增加了39.66%、58.82%、18.99%；游離氨顯著(P<0.05)增加了36.23%，pH顯著(P<0.05)增加了7.95%。與模型組相比，高劑量和中劑量的花椒精油可顯著降低盲腸總質量，分別降低了15.50%和12.07%；高、中、低劑量的花椒精油均顯著降低盲腸壁質量，分別降低了23.53%、29.41%、23.53%，可顯著降低盲腸內容物游離氨的含量，分別降低了16.64%、21.80%、21.65%；均有降低盲腸內容物pH的趨勢，其中高劑量降低顯著(P<0.05)；有降低盲腸表面積趨勢，但不顯著。說明，花椒精油可以改善因STZ誘導的盲腸組織腫大，減少游離氨、酚類物質等對腸道上皮傷害，具有維持因STZ誘導的1型糖尿病小鼠腸道健康的作用。

表4 花椒精油對小鼠小鼠盲腸及其微環境的影響 (n=10)

2.5 花椒精油對小鼠盲腸內容物中短鏈脂肪酸的影響

花椒精油對糖尿病小鼠盲腸內容物中短鏈脂肪酸的影響見表5。與空白組相比，模型組盲腸內容物中丙酸、丁酸、戊酸和SCFA均顯著(P<0.05)降低，分別降低了34.39%、37.93%、20.86%和32.40%；異丁酸有降低趨勢，但不顯著。與模型組相比，花椒精油可顯著(P<0.05)增加小鼠盲腸內容物中丙酸、丁酸、戊酸和SCFA的量，而對異丁酸的影響不顯著。實驗表明，劑量組對短鏈脂肪酸的含量增加有顯著的效果，并且增加的效果由花椒精油的濃度增加而增加。

表5 花椒精油對小鼠盲腸內容物中短鏈脂肪酸的影響(n=10)

2.6 花椒精油對小鼠盲腸內容物中微生物的影響

花椒精油對糖尿病小鼠盲腸內容物中微生物的影響見表6。與空白組相比，盲腸內容物中乳酸桿菌、雙歧桿菌和梭菌均顯著(P<0.05)降低，分別降低了38.99%、28.22%、11.75%；擬桿菌也有下降(2.86%)趨勢，但不顯著。顯著增加腸桿菌和腸球菌的量，分別增加了29.69%、26.09%。與模型組相比，花椒精油可顯著增加乳酸桿菌和雙歧桿菌的量；高、中、低劑量組乳酸桿菌分別增加了22.71%、14.53%、11.86%；而雙歧桿菌的量分別增加了12.07%、5.42%、4.80%。高、中、低劑量組可顯著(P<0.05)降低腸桿菌的量，分別降低了7.25%、4.60%、3.57%；高和中劑量組可顯著(P<0.05)降低腸球菌的量，分別降低了17.73%、9.78%。結果表明，花椒精油有促進盲腸內容物中有益菌的生長，抑制有害菌的生長。

表6 花椒精油對小鼠盲腸內容物中微生物的影響(n=10) log10copies/g

3 討論

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種以高血糖為特征的代謝紊亂性疾病群，主要包括1-型、2-型和妊娠性糖尿病[28]，1-型是胰島素分泌絕對不足引起的，2-型是胰島素分泌相對不足或受體受阻引起的[17]。鏈脲佐菌素(STZ)通過葡萄糖轉運體(GLUT2)進入β細胞，引起DNA烷基化，進而使β細胞發生壞死，減少或終止動物胰島素分泌，導致血糖升高，因其造模成功率高、死亡率低、穩定、作用機制清楚而被廣泛用于誘導動物實驗性糖尿病[29,30]。本實驗采用一次性腹腔注射150 mg/kg bw STZ一周后，就出現多飲、多食、多尿、體重減輕，同時活動量明顯減少、精神萎靡、體毛蓬松等典型的糖尿病癥狀[31-33]。實驗期內模型對照組血糖值始終大于11.1 mmol/L，說明造模成功且比較穩定[19-21]。與模型對照相比，高、中、低劑量花椒精油均有顯著的降低空腹血糖的效果，這可能與花椒精油中含有烯烴類和酮(醛)類等物質有關[27]。甘芝霖[34]研究表明，同樣作為調品味使用的孜然(CuminumcyminumL.)精油中Y-萜品烯可以顯著降低2-型糖尿病大鼠血清中糖化血紅蛋白、甘油三酯及膽固醇的含量水平，并顯著提高胰島素的含量，從而對2-型糖尿病起到一定的治療作用。 Farrokhfall K等[35]研究肉桂植物精油的主要活性成分肉桂醛降糖機制，肉桂醛可通過改善胰島細胞的氧化應激和炎癥狀態，防止胰島β-細胞損傷，推測花椒精油降血糖的作用機制可能與此相似。

糖尿病患者由于長期代謝異常和高血糖狀態，往往會伴有多種并發癥，其中也會使腸道內微生態受到嚴重影響[36,37]。不過，也有研究證明，腸道菌群失調也是引起糖尿病的一個重要原因[38,39]。在腸道內菌群失調時，腸道內益生菌如雙歧桿菌數量減少，而一些有害菌如大腸桿菌和梭菌的數量上升，使體內尿堿合成受阻，因此游離氨數量增加，促使腸道內pH升高，使更多有害菌大量繁殖[40-42]。而花椒精油可顯著降低盲腸總質量、盲腸壁質量和盲腸內容物游離氨的含量(表4)，均有降低盲腸內容物pH值和盲腸表面積的趨勢(表4)。說明，花椒精油可以改善因STZ誘導的盲腸組織腫大，減少游離氨等對腸道上皮傷害，具有維持因STZ誘導的1型糖尿病小鼠腸道健康的作用。

腸道內厭氧菌的數量和代謝情況可以通過短鏈脂肪酸(SCFA)的組成和總量來間接體現[43,44]。與空白組相比，模型組盲腸內容物中丙酸、丁酸、戊酸和SCFA均顯著(P<0.05)降低(表5)；這與以往的研究相一致[46,47]。研究表明，糖尿病會導致短鏈脂肪酸含量下降，原因可能是因為糖尿病導致腸道菌群穩態失調，導致致病菌生長，抑制有益菌生長，降低腸道內的發酵反應，減少短鏈脂肪酸的生成[48,49]。而給予花椒精油灌胃28 d后，可顯著(P<0.05)增加小鼠盲腸內容物中丙酸、丁酸、戊酸和SCFA的量(表5)。表明花椒精油具有增加腸道內的發酵反應，提高短鏈脂肪酸含量，改善因糖尿病導致小鼠腸道菌群穩態失調的作用。而陳康等[50]發現，長鏈菊粉可通過改善腸道微生物的穩態來緩解1型糖尿病小鼠的炎癥狀況和發病進程。推測，花椒精油對1型糖尿病小鼠血糖代謝的影響與其改善腸道微生物的穩態、減少炎癥和氧化應激有關，其具體作用機制有待進一步研究。

周興婷等[49]研究表明，Lactobacillus 和 Ruminococcus 與短鏈脂肪酸的生成呈正相關性，且與乙酸、丁酸和丙酸的生成呈正相關性，而 Akkermansia 和Bifidobacterium 與丁酸的生成呈正相關性。Ruminococcus[51]是公認的產丁酸的菌，腸道丁酸的減少會促進炎癥反應，進而破壞正常的腸道屏障功能，糖尿病會使機體腸道產丁酸菌的豐度的顯著下降。實驗結果表明，采STZ誘導的糖尿病小鼠盲腸內容物中乳酸桿菌、雙歧桿菌和梭菌均顯著(P<0.05)降低，顯著增加腸桿菌和腸球菌的量(表6)，這與以往的研究結果相一致。而花椒精油可顯著增加乳酸桿菌和雙歧桿菌的量，可降低腸桿菌和腸球菌的量。以上結果表明，花椒精油可增加糖尿病小鼠盲腸內容物丁酸、丙酸和戊酸的含量，改善腸道菌群的豐度，增加有益菌乳酸桿菌和雙歧桿菌的量，減少致病菌低腸桿菌和腸球菌的量，在一定程度上緩解了STZ誘導的1型糖尿病的腸道失調。

4 結論

花椒精油能夠改善1型糖尿病小鼠的腸道健康，其可能機制是促進腸道有益菌的生長，抑制腸道有害菌的生長，從而改善其腸道微環境。但花椒精油對糖尿病機體降血糖的作用機制，腸道健康與降血糖的關聯性，花椒精油改善糖尿病機體的腸道健康的主體成分，量效關系及作用機制等等均有待進一步研究。