不同類型大豆萌發(fā)期維生素E組分及含量的比較

趙 霞 曹改萍 王 敏 岳愛琴 張永坡 高春艷 牛景萍 趙晉忠 杜維俊

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)1，太谷 030801)(山西省農(nóng)業(yè)種子總站2，太原 030000)

大豆作為我國糧油兼用作物，具有重要的營養(yǎng)、保健和工業(yè)價值。在大健康背景下，我國農(nóng)業(yè)將從高產(chǎn)農(nóng)業(yè)、綠色農(nóng)業(yè)進(jìn)入到功能農(nóng)業(yè)發(fā)展階段，農(nóng)產(chǎn)品的市場結(jié)構(gòu)和消費需求將發(fā)生重要變化，飲食已向營養(yǎng)健康安全方向發(fā)展，而發(fā)芽大豆正好能滿足人們的這些需求。同時，發(fā)芽大豆制品的加工與應(yīng)用能幫助提高大豆生產(chǎn)的附加值，充分利用現(xiàn)有農(nóng)業(yè)資源。發(fā)芽大豆作為一種新的“醫(yī)食同源”的功能性主食，對于提高人民生活質(zhì)量有著重要的作用。豆芽在生產(chǎn)的過程中，進(jìn)行著一系列的物質(zhì)轉(zhuǎn)化。例如，在水解酶的作用下，將高分子貯藏的物質(zhì)轉(zhuǎn)為可溶性的、人體易吸收的簡單物質(zhì)。研究表明，大豆在萌芽過程中營養(yǎng)成分和生物活性成分均有提高。

維生素E具有獨特的生理功能，對人體健康至關(guān)重要。維生素E，又叫做生育酚(Tocopherol)，是一種可溶于有機溶劑的粘稠油狀淡黃色物質(zhì)，主要存在于植物油中，富集于谷物種子的胚芽油及大豆油等油脂中[1，2]，因苯環(huán)上取代基的甲基位置和數(shù)量不同有四種生育酚和四種生育三烯酚存在。生育酚主要存在于植物體內(nèi)，動物油脂中含量極低[3]。迄今為止，自然界已知維生素有 α、β、γ、δ-生育酚和及其相應(yīng)的三烯生育酚共8種異構(gòu)體。大豆中只含有4種生育酚，且β-生育酚只占總維生素E含量的1%[4，5]。因α-生育酚的生物活性和抗氧化能力最強，通常將α-生育酚作為維生素的代表對其進(jìn)行各種生理生化功能的研究[6，9]。天然維生素E主要存在于以大豆為代表的油料作物中。大豆品種及其制品維生素E含量變化規(guī)律對于充分利用大豆資源附加值至關(guān)重要。富集維生素E含量芽豆品種是大豆品質(zhì)育種的重要研究內(nèi)容之一。花生中生育酚含量在發(fā)芽前2～3 d明顯增加之后開始下降，變化幅度因品種而異[10]。目前關(guān)于萌芽過程中大豆維生素E組分及含量動態(tài)變化規(guī)律的研究還鮮見報道，本研究通過對大豆發(fā)芽期間維生素E組分及含量進(jìn)行檢測, 比較發(fā)芽期間各組分及含量的變化, 以期為篩選萌芽過程富積維生素E組分的大豆優(yōu)良品種以及萌芽大豆功能食品開發(fā)提供了一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

依托山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆種質(zhì)資源圃，選擇8種不同類型的栽培大豆，詳情見表1。

表1 各品種栽培大豆的基本表征

1.2 主要儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀；GT200型震動球磨儀；ATS.D5-2M型真空冷凍干燥機；KM-300DE型超聲震蕩清洗器；MultiVap-8型平行濃縮儀；QL-901 Vortex型旋渦混合器；BIC-400型人工氣候箱。

α、γ、δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品，純度均≥98%；甲醇，為HPLC級；抗壞血酸、70%乙醇、正己烷、次氯酸鈉，為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 大豆籽粒發(fā)芽

采用培養(yǎng)皿濾紙法進(jìn)行萌發(fā)實驗。挑選外觀飽滿、大小一致、無蟲蛀、無霉變的新鮮大豆種子，用清水去除表面雜質(zhì)。用0.1% NaClO溶液浸泡10 min進(jìn)行消毒，蒸餾水清洗3次后，在25 ℃條件下蒸餾水(料液比1∶2)中浸泡6 h。取滅菌培養(yǎng)皿(直徑12 cm)于其中鋪設(shè)2層濾紙，將處理后種子均勻放置其中，每皿分別放置50粒，每個品種8個培養(yǎng)皿，每組設(shè)置3次重復(fù)。將處理好的培養(yǎng)皿放入人工氣候箱中培養(yǎng)，萌發(fā)條件為黑暗、25 ℃、相對濕度為80%。每隔24 h更換培養(yǎng)皿的蒸餾水，整個發(fā)芽期為7 d，每隔24 h取樣，置于-20 ℃冰箱中24 h，再放入真空冷凍干燥機中冷凍干燥48 h，后將樣品使用球磨儀磨成粉，真空包裝后置25 ℃ 干燥箱保存用于后續(xù)實驗；同時每天進(jìn)行大豆發(fā)芽數(shù)和胚根長的統(tǒng)計。

1.3.2 維生素E組分測定1.3.2.1 樣品前處理

本實驗的方法基于李海燕等[11]的方法略有改動。準(zhǔn)確稱取0.100 g大豆凍干粉于10 mL離心管中，加入0.125 0 g抗壞血酸，加70%乙醇溶液，震蕩混勻15 s后超聲震蕩提取20 min，加入6 mL正己烷，震蕩混勻20 s后超聲震蕩萃取15 min，12 000r/min離心8 min，使用平行濃縮儀用N2將上清液吹干，復(fù)溶于1 mL甲醇中，過0.22 μm濾膜于液相色譜專用小瓶中待測。

1.3.2.2 色譜條件

利用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)，采用外標(biāo)法對維生素E各組分進(jìn)行定量分析。色譜柱：ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，0.5 μm)；流動相：甲醇；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；二極管陣列檢測器(DAD檢測器)：檢測波長295 nm；運行時間：12 min。以α、γ、δ-生育酚的峰面積代入回歸方程進(jìn)行定量分析[12,13]。

1.3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

精密稀釋五個濃度梯度的α、δ、γ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品，在選定的色譜條件下分別進(jìn)樣，以濃度X(μg/mL) 對峰面積Y作圖，用Excel軟件進(jìn)行回歸擬合，即得到α、δ、γ-生育酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.3.2.4 維生素E組分含量的計算

根據(jù)各生育酚峰的回歸方程，可計算得到待測溶液中各生育酚的濃度c，進(jìn)一步計算得到樣品中各生育酚的含量Xi。

式中：Xi為樣品中大豆維生素E組分的含量/μg/g；c為樣品中各生育酚濃度/μg/mL；V為樣品總體積/mL；m為樣品質(zhì)量，樣品為脫水大豆粉/g。

1.3.3 發(fā)芽率、發(fā)芽勢測定

大豆種子發(fā)芽率=(發(fā)芽大豆種子數(shù)量/供試大豆種子數(shù)量)×100%

大豆種子發(fā)芽勢=(第3天發(fā)芽大豆種子數(shù)量/供試大豆種子數(shù)量)×100%

1.3.4 實驗數(shù)據(jù)的分析與處理

采用Graph Pad Prism 5、SPSS、Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系及檢出限

配制不同濃度梯度的α、γ、δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液經(jīng)HPLC分析后，以濃度X(μg/mL) 對峰面積Y作圖，用Excel軟件進(jìn)行回歸擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，以信噪比S/N=3計算，測得α、γ、δ-生育酚的檢出限，見表2。標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖見圖1。

表2 生育酚HPLC測定時濃度X(μg/mL)與峰面積Y的關(guān)系

2.2 回收率和精密度

將α、γ、δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋到一個低濃度下經(jīng)HPLC測定其峰面積，重復(fù)6次。經(jīng)計算得出回收率的范圍為96.9%～101.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2，可用于維生素E各組分的定量分析，詳情見表3。

表3 回收率和精密度測定結(jié)果

2.3 大豆萌發(fā)期各指標(biāo)的變化

2.3.1 大豆萌發(fā)期間發(fā)芽率及發(fā)芽勢的變化

由圖2可知，各大豆材料萌發(fā)期間發(fā)芽率變化趨勢基本一致，均呈現(xiàn)遞增趨勢，大豆發(fā)芽率變化分兩個階段，即前3 d快速增加階段和3～7 d緩慢增加階段。且前期增長幅度大于后期。這種情況可能與前期萌動活躍有關(guān)。趙甲慧[14]研究表明，大豆發(fā)芽時在前36 h 處于緩慢生長階段，在36～72 h時處于快速生長階段，這種情況是大豆內(nèi)源酶活力不斷增強的結(jié)果。不同品種發(fā)芽率、發(fā)芽勢增加速度存在差異，統(tǒng)計分析表明黃色種皮大豆的發(fā)芽率顯著低于黑色種皮和綠色種皮大豆。其中PJ2491的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均最高，晉大53的發(fā)芽率、發(fā)芽勢相對低于其他品種，反映了不同品種發(fā)芽相關(guān)基因組成的差別。

圖2 各品種大豆萌發(fā)期間發(fā)芽率

2.3.2 大豆萌發(fā)期間胚根長的變化

由圖3可知，各材料萌發(fā)期間胚根長度的變化呈現(xiàn)逐漸遞增趨勢，這種情況是發(fā)芽過程中代謝酶活性逐漸增加表現(xiàn)。但不同材料增加幅度不同，且從大到小依次為PJ2491>SZ849>晉豆19>SZ958>武鄉(xiāng)小黑豆>SZ910>晉大53>汾豆78。表明發(fā)芽過程中胚根生長存在品種基因型的差異。統(tǒng)計分析表明黃色種皮大豆的胚根長顯著低于黑色種皮和綠色種皮大豆。

圖3 各品種大豆萌發(fā)期間胚根長

2.3.3 大豆萌發(fā)期間維生素E各組分的變化

由圖4可知，8份大豆材料萌發(fā)期間α-生育酚含量變化趨勢不同。兩個綠仁大豆SZ910 和SZ958的α-生育酚含量在發(fā)芽第1天時α-生育酚含量達(dá)到最大值，分別為123.6 μg/g和92.5 μg/g，較干種子增幅分別為28.9%和26.9%。其中，黑皮綠仁大豆SZ910整個發(fā)芽期間呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，綠皮綠仁大豆SZ958呈現(xiàn)出先增后減再增的趨勢。綠仁大豆萌發(fā)過程中維生素E含量整體呈下降趨勢，這與Liu等[15]研究甜玉米在黑暗條件下發(fā)芽過程維生素E含量變化趨勢一致。黃仁大豆除晉豆19號表現(xiàn)為先減后增的趨勢外，其他品種萌發(fā)期間α-生育酚含量呈現(xiàn)平緩上升趨勢，均在萌發(fā)后第7天，α-生育酚含量最高，這與花生[16]、南瓜籽研究相符合[17]。不同大豆材料萌發(fā)期間α-生育酚含量變化存在差異，表明α-生育酚含量與種皮和種仁色存在一定相關(guān)，也與品種和具體發(fā)芽狀態(tài)有一定關(guān)系。

圖4 各品種大豆萌發(fā)期間α-生育酚含量

由圖5可知，8份大豆材料萌發(fā)期間，武鄉(xiāng)小黑豆的γ-生育酚含量呈現(xiàn)出先增后減再增的趨勢，萌發(fā)后第7天含量最高，為66.0 μg/g。晉豆19與SZ849呈現(xiàn)出先減后增的趨勢，含量最高在第7天，分別為95.4、67.1 μg/g。其他材料均呈現(xiàn)先增后減的趨勢，其中綠皮黃仁PJ2491的γ-生育酚含量于第4天達(dá)到最大值，為117.3 μg/g。表明γ-生育酚含量與品種和具體發(fā)芽狀態(tài)有一定關(guān)系。

圖5 各品種大豆萌發(fā)期間γ-生育酚含量

由圖6可知，除SZ849外，其他材料萌發(fā)期間δ-生育酚含量變化趨勢大致相同。SZ849呈現(xiàn)出先減后增再減的趨勢，萌發(fā)前干種子中δ-生育酚含量最高，為30.3 μg/g。其他材料均呈現(xiàn)先增后減的趨勢，其中SZ910的δ-生育酚在整個時期均高于其他材料，萌發(fā)后第2天達(dá)到最大值，為48.3 μg/g。表明δ-生育酚含量與品種和具體發(fā)芽狀態(tài)有一定關(guān)系。

圖6 各品種大豆萌發(fā)期間δ-生育酚含量

由圖7可知，8份大豆材料萌發(fā)期間維生素E總含量最高的為SZ910，于第1天達(dá)到最大值，為237.1 μg/g，呈現(xiàn)先增后減的趨勢。晉豆19與之變化趨勢相反，萌發(fā)后第7天總維生素E含量最高，為174.3 μg/g。SZ958與晉大53呈現(xiàn)先增后減再增的趨勢，武鄉(xiāng)小黑豆與其變化趨勢相反。PJ2491在萌發(fā)期間總維生素E含量呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢，于第7天含量達(dá)到最大值，為193.7 μg/g。汾豆78與SZ849在整個萌發(fā)過程中總維生素E變化不顯著。表明維生素E總含量與品種和具體發(fā)芽狀態(tài)有一定關(guān)系。

2.4 大豆不同品種不同萌發(fā)期間各生育酚含量比較

2.4.1 不同種仁色大豆不同萌芽時期各維生素組分及含量比較

由圖8可知，不同大豆材料萌發(fā)過程中維生素E及其各組分的含量存在較大差異，黃仁大豆萌發(fā)期間γ-生育酚含量大于α-和δ-生育酚含量；綠仁大豆各組分含量表現(xiàn)為α-生育酚>γ-生育酚>δ-生育酚含量。黃仁大豆與綠仁大豆萌發(fā)過程中不同時期的α-生育酚含量之間均有極顯著差異，且各時期的α-生育酚含量表現(xiàn)為綠仁大豆顯著高于黃仁大豆。黃仁大豆萌芽期較干種子α-生育酚含量增幅范圍在-23.2%～46.3%，綠仁大豆較干種子增幅范圍為-17.1%～28.1%。萌發(fā)過程中黃仁大豆的γ-生育酚含量高于綠仁大豆，其中，第0、6、7天的黃仁大豆與綠仁大豆的γ-生育酚含量之間具有顯著差異，其他時間之間的差異未達(dá)到顯著水平。黃仁大豆和綠仁大豆二者萌發(fā)期的γ-生育酚含量較干種子比較增幅不同，增幅范圍分別為-1.4%～8.8%和10.3%～23.2%。萌發(fā)過程中綠仁大豆的γ-生育酚含量高于黃仁大豆, 黃仁大豆與綠仁大豆萌發(fā)過程中不同時期的δ-生育酚含量之間差異均未達(dá)到顯著水平，二者萌發(fā)期的γ-生育酚含量較干種子增幅也不同，增幅范圍分別為11.5%～23.7%和10.3%～19.2%。這進(jìn)一步證明維生素E組分含量與大豆種仁顏色相關(guān)。這一結(jié)果與Ng等[18]研究結(jié)果相似，發(fā)芽過程中黑米維生素E含量高于白米。不同種仁色材料發(fā)芽階段維生素E組成含量呈現(xiàn)不同變化趨勢，這可能與它們自身的代謝特點以及大豆萌發(fā)不同階段對不同組分的需求不同有關(guān)。

注：圖中不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。余同。

2.4.2 不同種皮顏色大豆不同萌芽時期各維生素E組分及含量比較

如圖9a所示，萌發(fā)期間各顏色種皮大豆的α-生育酚含量之間均未達(dá)到顯著水平，各時期α-生育酚含量整體表現(xiàn)為綠色種皮大豆>黑色種皮大豆>黃色種皮大豆。如圖9b所示第1、4、5天的黑色種皮大豆與綠色種皮大豆的γ-生育酚含量之間具有顯著差異，其他時期均未達(dá)到顯著水平，黑色種皮大豆中γ-生育酚含量明顯低于黃色和綠色種皮大豆，在萌發(fā)第4天綠色種皮大豆的γ-生育酚含量達(dá)到最大值為61.5 μg/g。如圖9c所示大豆萌發(fā)過程中僅第0天黃皮大豆與黑皮大豆的δ-生育酚含量之間有顯著差異，其他時期均未達(dá)到顯著水平。這一結(jié)果進(jìn)一步證明維生素E組分含量與大豆種皮顏色相關(guān)。

圖9 不同種皮顏色大豆萌芽各時期維生素E組分及含量的比較

3 討論

3.1 HPLC法測定維生素E組分及含量的準(zhǔn)確性

本研究結(jié)果表明，維生素E各組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值均達(dá)到了0.999 7以上，維生素E各組分的回收率介于96.9%～101.2%之間，測定結(jié)果的重現(xiàn)性和精密度良好，可以準(zhǔn)確定量維生素E的含量，這與王麗等[2]研究生育酚異構(gòu)體回收率的結(jié)果一致。

3.2 大豆萌發(fā)期維生素E組分含量變化及其原因分析

8份大豆材料籽粒維生素E及其組分含量品種間及不同萌發(fā)期間差異較大。在發(fā)芽的某個或某些階段維生素E組分含量基本上都發(fā)生了明顯增加。但總體變化趨勢不一致，體現(xiàn)了品種和發(fā)芽階段的差異性。發(fā)芽后，維生素E組分含量變化原因可能多方面的。推測可能的原因為：1)發(fā)芽過程中各種代謝酶活性增強，促進(jìn)了維生素E組分合成前體轉(zhuǎn)化為維生素E；2)發(fā)芽過程中，受到外界環(huán)境條件的誘導(dǎo)，苯丙氨酸合成途徑開啟，合成苯丙氨酸和其他相關(guān)酚類物質(zhì)；3)發(fā)芽過程中受外界條件的脅迫產(chǎn)生更多自由基，也將消耗更多具抗氧化活性的成分。前2個原因使維生素E組分含量檢測值升高，而第3個原因使其含量降低。三者協(xié)同作用表現(xiàn)出發(fā)芽期維生素E組分含量變化。維生素E是一種很強的脂溶性抗氧化劑，而非酶脂質(zhì)在幼苗生長發(fā)育早期的氧化損傷發(fā)揮了重要的抑制作用[19]。有研究表明發(fā)芽糙米多酚提取物清除羥基自由基、超氧陰離子和還原能力分別比糙米原料高40%、 24.34%、-1.84倍, 對延緩植物油脂的酸敗效果明顯好于原料糙米。有研究表明，維生素E的積累與植株受到的脅迫程度、脅迫的敏感程度以及植株自身的生理狀態(tài)有關(guān)[20,21]。本研究采用不同種皮色和種仁色大豆為材料，檢測到大豆維生素E組分在萌發(fā)前后發(fā)生了明顯的變化，這基本反映了維生素E組分的變化趨勢。而對于維生素E組分在萌發(fā)前后的變化機理尚不清楚，有待于繼續(xù)分析。

3.3 大豆萌發(fā)期間各生育酚含量與品種種仁和種皮色的關(guān)系

大豆萌發(fā)期間黑皮綠仁大豆SZ910的α-生育酚含量顯著高于其他品種，這與劉婷婷等[22]研究發(fā)芽綠豆的總酚含量高于其他顏色大豆的結(jié)果一致，與鞏藹等[23]研究云南特色綠豆類的酚類含量高于白豆類結(jié)果一致。大豆萌發(fā)過程中綠仁大豆的α-生育酚與總維生素E含量較高，表明綠仁大豆萌發(fā)過程中比其他品種富含維生素E。而γ-生育酚與δ-生育酚含量變化趨勢差異較大，這與Fernandez等[24]的研究結(jié)果相似，說明其他生育酚含量的變化取決于大豆的品種。

大豆萌發(fā)過程中，黃仁大豆的α-生育酚含量在第7天時達(dá)到最大值，較干種子中α-生育酚含量增幅46.3%，這與Zhou等[25]、王琳珍[26]分別研究苦蕎、黃豆萌發(fā)期間α-生育酚含量變化趨勢相似。綠仁大豆的α-生育酚含量在第1天達(dá)到最大值，較干種子中α-生育酚含量增幅25.4%，且任何時期整體表現(xiàn)為綠仁大豆含量高于黃仁大豆。大豆萌發(fā)過程中，其生長發(fā)育完全依賴于自身儲存的脂質(zhì)代謝來提供能量，本研究猜測萌發(fā)期間綠仁大豆α-生育酚含量達(dá)到最大值比黃仁大豆α-生育酚含量達(dá)到最大值的時間早，可能是因為萌發(fā)早期綠仁大豆抵御外界脅迫及自身調(diào)節(jié)能力弱有關(guān)，黃仁大豆的α-生育酚含量萌發(fā)期間呈遞增趨勢，可能與其自身生長發(fā)育慢，易發(fā)霉有關(guān)。α-生育酚除了在動物繁殖中起著至關(guān)重要的作用外，還被證明對人類健康有著有益的作用[27]，尤其是可以提高生育能力[28]，抑制肺癌[29]，延緩大腦老化和降低阿爾茨海默病的風(fēng)險[30]，抑制膽固醇的生成[31,32]。因此，大豆芽在制備過程中可根據(jù)不同仁色大豆而選擇α-生育酚含量最高的時間進(jìn)行培育。

綠色種皮大豆中的γ-生育酚含量相較高于其他顏色種皮大豆，而γ-生育酚在預(yù)防閉塞性血栓形成方面比α-生育酚更有效[33]，因此，若需選育高γ-生育酚含量的大豆品種可根據(jù)大豆種皮顏色進(jìn)行選擇。萌發(fā)期間綠色和黑色種皮顏色大豆中δ-生育酚含量較高于黃色種皮大豆，有研究表明，δ-生育酚對于前列腺防治[34]、乳腺癌防治[35]等疾病具有更顯著的功效，因此，若選育高δ-生育酚含量的大豆品種可選擇綠色和黑色種皮大豆。

4 結(jié)論

HPLC法測定大豆維生素E組分及含量的結(jié)果重現(xiàn)性和精密度良好，可以準(zhǔn)確定量大豆維生素E組分及含量。不同大豆材料萌發(fā)過程中維生素E及其各組分的含量存在較大差異，黃仁大豆萌發(fā)期間γ-生育酚含量大于α-和δ-生育酚含量；綠仁大豆各組分含量表現(xiàn)為α-生育酚>γ-生育酚>δ-生育酚含量。大豆發(fā)芽后α-生育酚含量都較干種子增加，其中黃仁大豆在發(fā)芽第7天的α-生育酚含量最高，綠仁大豆在第1天含量最高，并且綠仁大豆所含α-生育酚含量顯著高于黃仁大豆，而綠色種皮和黃色種皮大豆的γ-生育酚高于黑色種皮大豆。本研究為育種工作者篩選萌芽過程富積維生素E組分及含量的大豆優(yōu)良品種以及萌芽大豆功能食品開發(fā)提供了一定的參考依據(jù)。