大豆發芽過程中抗原蛋白降解及營養特性變化

安廣杰 靳 穎 張培旗 胡金強 趙學偉 劉 洋 王章存

(鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，鄭州 450001)

大豆是我國的重要經濟作物，不僅是食用油的重要來源，也可為食品工業提供大量的蛋白質[1]。而且大豆蛋白質的氨基酸比例合理，與FAO/WHO 的推薦模式相近，有利于人體的消化與吸收。另外，大豆蛋白具有一定的乳化性、發泡性等，在食品加工中應用有利于改善食品的感官品質[2，3]。

然而，大豆又是國際公認的八大致敏食物之一。大豆蛋白在機體內可以引起一種由特異性IgE介導的，由細胞免疫和體液免疫共同作用的混合型的過敏反應[4]，其癥狀表現為腹瀉、皮疹、蕁麻疹，嚴重的伴有顫抖、咽喉水腫和急性哮喘等癥狀。目前，世界范圍內13%的兒童和0.5%的成人都對大豆有不同程度的過敏癥狀，嚴重影響了大豆的食用價值。大豆蛋白的致敏性對人體生長發育的不良影響成為全世界廣泛關注的公共衛生問題[5]。

大豆發芽是一種常見的加工方式，豆芽也是人們喜愛的傳統優質食品。大豆發芽過程中發生一系列的代謝活動，產生多種生物活性物質，也有利于促進人體對大豆營養成分的消化與吸收，具有豐富的營養價值[6]。目前關于大豆發芽過程中營養成分的變化報道較多[7，8]。但涉及發芽中大豆抗原蛋白分子成分和抗原活性及其變化規律的報道極少。此次研究了不同發芽過程中的抗原蛋白的分子成分、主要抗原蛋白的抗原活性以及氨基酸、異黃酮、抗壞血酸等營養成分的變化，為開發低致敏性的大豆發芽產品提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

市售非轉基因大豆、大豆β-伴球蛋白ELISA 試劑盒、大豆球蛋白ELISA試劑盒、低分子質量標準蛋白、考馬斯亮藍R-250、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺(Acr)，2,6-二氯靛酚、純抗壞血酸、染料木素。

1.2 主要儀器

LRH-系列生化培養箱，FD-1-50型冷凍干燥機，JSM-7001F型場發射掃描電子顯微鏡，DYY-6C型電泳儀，835型氨基酸分析儀，iMark酶標儀，UV-8100 B紫外可見分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 發芽大豆制備[9]

選取外觀良好、籽粒飽滿、大小均勻的大豆，將其分為七份，每份80粒，稱重并記錄數據。用蒸餾水沖洗數次后，將其浸泡于1.5%的次氯酸鈉溶液中漂洗3次，浸泡在蒸餾水中12 h后，置于25 ℃生化培養箱中避光培養，每隔12 h澆一次水，每24 h取樣一次，至第7 d結束。將取出的樣品置于-20 ℃冷凍干燥、稱重后保存。并分別與未發芽大豆干物質作對比計算干物質損失率(%)。

1.3.2 發芽不同時期大豆樣品的結構形態變化

將冷凍干燥后的樣品粉碎、過200目篩、分裝貼標，對上述樣品進行噴金鍍膜處理，使用場發射掃描電子顯微鏡(FESEM)進行觀察。

1.3.3 蛋白質分子質量的測定

將發芽和未發芽大豆的干燥物粉碎過200目篩，用Tris-Cl緩沖液(pH8.0)提取蛋白[10]。采用Laemml方法做SDS-PAGE電泳分析[11]。濃縮膠和分離膠濃度分別為5%和12%，考馬斯亮藍R-250染色，脫色后觀察譜帶變化。

1.3.4 大豆樣品抗原活性的測定

稱取不同樣品粉末各50 mg，用Tris-Cl緩沖液(pH8.0)緩沖液提取蛋白。分別采用競爭法7Sβ-伴球蛋白和11S大豆球蛋白ELISA試劑盒檢測抗原活性。具體操作步驟按照ELISA試劑盒說明書。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD 值)，并通過標準曲線計算樣品中抗原蛋白濃度。每個樣品測定重復三次，以發芽樣品測定結果與未發芽大豆結果的比值表示抗原活性剩余率/%，考查發芽過程中的抗原活性變化。數據采用ORIGIN 8.0軟件處理。

1.3.5 氨基酸含量的測定

按照GB 5009.124—2016 食品安全國家標準食品中氨基酸的測定。主要步驟為：稱取粉末樣品各50 mg，用6 mol/L鹽酸于110 ℃水解24 h，用氨基酸分析儀測定，色譜柱為磺酸型陽離子樹脂，衍生劑為茚三酮，檢測波長570 nm和440 nm。

1.3.6 抗壞血酸含量測定

以2,6-二氯酚靛酚滴定法測定[12]。用2%的草酸溶液提取，以0.1 mg/mL的純抗壞血酸溶液作為標準溶液。每份樣品重復3次。

2 結果與分析

2.1 大豆在發芽過程中干物質含量的變化

大豆種子萌發過程中將進行一系列新陳代謝活動。發芽前期，主要進行蛋白質、碳水化合物和脂肪的降解[13]。圖1顯示，大豆在發芽過程中干物質損失率不斷增加，即干物質含量不斷減少，至發芽7 d時干物質損失24.6%。盡管發芽過程不斷有新的蛋白質和糖類物質的合成，但在避光培養時，由于不能進行光合作用，大豆干物質一致呈現減少的趨勢。

圖1 大豆在發芽過程中干物質含量變化

2.2 大豆在發芽過程中組織結構的變化

大豆吸水和發芽過程中，其組織結構發生較大變化。圖2是利用場發射電子顯微鏡對樣品表面超微形貌觀察結果?？梢钥闯?，隨著發芽時間的增加大豆子葉的孔徑逐漸變大、結構變得越來越疏松。蛋白體逐漸融合形成大液泡, 原質體出現稀疏的片層結構。這與文獻通過電鏡觀察的現象吻合[14]。文獻中通過電鏡觀察到大豆隨發芽時間的增加其子葉細胞內含物不斷被消解；發芽第6天的大豆中有些蛋白體內只存有稀薄的絮狀蛋白質，蛋白體膜清晰可見，甚至有的蛋白體基質已消失殆盡[14]。

圖2 大豆在發芽過程中形態結構變化

這種結構有利于各種酶的活化和釋放，進一步促進各種代謝活動，包括抗原蛋白的降解、豆芽生長需要的各種成分的合成等[15]。大豆中主要的蛋白是7S和11S儲存蛋白，也是抗原活性較高的抗原蛋白。由此可以推斷，大豆在發芽過程中抗原性可能會因為蛋白質的降解而降低。

2.3 大豆在發芽過程中蛋白質成分的變化

為了分析發芽過程中大豆蛋白的降解情況，本文將發芽不同時間樣品做的SDS-PAGE，結果如圖3所示，隨著發芽時間的延長，大豆蛋白質的分子量呈現規律性變化，分子量較大的蛋白質逐漸減少，小分子蛋白逐漸增加。在發芽3 d時(泳道3)，大豆β-伴球蛋白的α′-和α-亞基顏色明顯變弱，發芽5 d時，兩個亞基幾乎完全消失。相對而言，β-亞基降解較慢，發芽前3 d內譜帶顏色幾乎沒有變化，發芽5 d時才明顯變弱?？赡苁怯捎讦聛喕噍^于α′和α亞基的結構更加穩定，不容易受到外界影響，因此不易發生降解[16，17]；在體外用商品蛋白酶制劑水解大豆蛋白時也出現了相似的規律[18]。

注：M：Marker；0:原始大豆；1:發芽1 d；2:發芽2 d；3:發芽3 d；4:發芽4 d；5:發芽5 d；6:發芽6 d 7:發芽7 d。

大豆11S球蛋白的酸性鏈在發芽到第4 d后迅速降解，發芽至5 d時，幾乎看不到酸性肽鏈的存在，而堿性鏈在發芽6 d時譜帶顏色仍然較深，降解不明顯。這可能是與大豆球蛋白的晶體結構特點有關，酸性肽鏈比堿性肽鏈更容易發生水解，故酸性肽鏈消失的比較快[19]。

另外，大豆發芽3 d時，還產生了分子量范圍大致為23～30 ku的4條新譜帶，圖中所示d、e、f 3個譜帶顏色較深)，這些譜帶是伴隨著β-伴球蛋白的α′-和α-亞基的譜帶減弱而出現的，推測它們可能是α′-和α-亞基降解后的產物。而且其后隨著11S球蛋白酸性肽鏈譜帶降解和發芽時間延長，這幾條新生成的譜帶顏色還有加深的趨勢。有可能酸性肽鏈的降解后也形成了這些分子量相近的小肽。發芽過程中抗原蛋白分子的降解也意味中大豆抗原活性的降低。

Wilson等[20]曾報道了大豆發芽過程中和蛋白質亞基的變化，與本實驗的電泳圖譜有相似之處，但Wilson所用大豆實驗材料中有比11S的堿性肽鏈更小的組分(14、17 ku)存在?？赡芘c本研究的大豆品種有差異。

2.4 大豆發芽過程中的抗原活性變化

大豆發芽過程中，蛋白質分子發生不同程度的降解。為了探討其抗原活性變化，本研究分別采用專用ELISA試劑盒分別測定不同發芽時間7S β-伴球蛋白和大豆11S球蛋白的抗原活性。

由圖4a可知：隨著發芽時間的增加，大豆中7S β-伴" />球蛋白和大豆11S球蛋白的抗原活性均出現降低現象，但二者變化幅度和趨勢不同。在發芽的前4天中，β-伴球蛋白的活性剩余58%(即降低42%)，其后降低幅度較小，至發芽7 d時抗原性仍然達到52%。11S球蛋白的抗原活性變化較平穩，且變化幅度小于β-伴球蛋白，發芽7 d時抗原活性還有69%。

圖4 大豆在發芽過程中其抗原性的變化

2.5 大豆在發芽過程中氨基酸含量變化

大豆具有很高的營養價值，其中一個原因就是由于其含有多種人體必需的氨基酸且組分合理，故對不同時期豆芽樣品的氨基酸含量進行了測定與分析，以研究發芽處理對大豆的營養特性的影響，結果如表1所示。

由表1可知，大豆發芽過程中天冬氨酸的含量顯著增加，谷氨酸的含量明顯降低，其他氨基酸的含量沒有明顯變化，此結果與等研究發現的結果一致，說明大豆在發芽過程中天冬氨酸和谷氨酸參與的代謝活動旺盛[21，22]。

表1 大豆不同發芽階段的氨基酸總量 / (%，干基計)

2.6 發芽大豆中抗壞血酸含量的變化

抗壞血酸即維生素C對人體健康具有重要作用。干燥的大豆種子中總抗壞血酸含量極少，而發芽會使抗壞血酸含量增加[23]。為探究度發芽時期抗壞血酸的變化規律，對發芽不同時期豆芽的抗壞血酸含量測定結果如圖5所示。

圖5 大豆發芽過程中抗壞血酸含量變化

由圖5可以看出，發芽過程中大豆抗壞血酸含量呈現先增后降的趨勢，在第3 d達到最大值，與文獻中的結果相似[24]。據報道，發芽前期，大豆中半乳糖酸內酯脫氫酶活性較高，而此酶與抗壞血酸的合成密切相關[25]。但在發芽4 d后，參與合成抗壞血酸的酶基因表達水平降低[26]，從而導致抗壞血酸量減少。

3 結論

大豆發芽過程中，其組織結構形態、蛋白質分子成分、抗原活性和部分營養物質發生率規律性變化。子葉組織結構變得疏松，干物質含量逐步減少，大豆中的主要儲藏蛋白7S β-伴球蛋白的α′和α亞基和11S球蛋白的酸性鏈降解較快，而β-伴球蛋白的β-亞基和11S球蛋白的堿性肽鏈降解較慢。β-伴球蛋白和11S球蛋白的抗原活性在發芽前4 d中降低較快，后期變化不同明顯。氨基酸總量變化不大，但谷氨酸增加和天冬氨酸降低幅度較大?？箟难岷肯仍黾雍蠼档汀Ｋ?，在食用發芽大豆時仍然要注意食品安全性。