凍藏時間對非發酵面團流變特性及蛋白結構的影響

楊靜潔 張 波 張影全 郭波莉 顧熟琴

(北京農學院食品科學與工程學院1,北京 102206)(中國農業科學研究院農產品加工研究所2,北京 100193)

冷凍非發酵面團一般用于中國傳統面制品如速凍湯包、蒸餃、燒麥的生產，受到廣大消費者的青睞[1]。凍藏過程中面團品質會逐漸發生劣變，進而降低產品食用品質，縮短了產品的貨架期[2]。Bhattacharya等[3]將面團進行84 d凍藏、Phimolsiropol等[4]將面團進行118 d凍藏后，均發現凍藏過程中，面團質量降低，醒發時間延長，面團持氣性下降；Rashidi等[5]研究凍藏對法棍面包質構影響發現，在45 d的凍藏期內，面包的硬度、咀嚼性逐漸增加。Gaikwad等[6]研究冷凍雜糧面包面團發現，在凍藏的45 d內，面團黏性不斷上升，內聚性降低。Yi等[7]認為凍藏時間顯著影響面包面團的拉伸性；Sharadanant等[8]將面團凍藏112 d后發現，凍藏時間越長，面團的最大抗拉阻力越小，延伸性越大。

目前，國內外對于發酵面團及其加工制品在凍藏期間品質的變化已經有了較為全面的研究, 但是對傳統中式非發酵面團凍藏期間品質的變化鮮有報道。面團中游離巰基含量(-SH)可以反映面筋形成程度[9, 10]，面團中谷蛋白大聚體(GMP)含量決定面團面筋強度和面團特性[11]，蛋白質二級結構的變化與蛋白質的聚集行為有關[12]；流變學特性是面團最重要的特性之一，蠕變與恢復性可以反映面團加工過程中宏觀結構的變化[13]。本研究將非發酵面團在-18 ℃下進行凍藏，研究不同凍藏時間對非發酵面團質構的影響，并從動態流變特性、蠕變與恢復性、游離巰基含量、谷蛋白大聚體含量、蛋白質二級結構方面探究其品質變化，為傳統中式非發酵冷凍面團產品的冷凍工藝提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用市售小偃22號小麥籽粒，采用Buhler MLU 202 實驗磨制粉，出粉率約為70%。

實驗用小麥粉質量性狀見表1。

表1 實驗用小麥粉質量性狀

1.2 方法

1.2.1 面團制作

為保證面團的均一性，采用827504型粉質儀和面，當面團稠度達到500BU時取出面團，將面團分割成60 g的小面團，整形后用保鮮膜包裹，置于-30 ℃超低溫冰箱中進行冷凍。當面團中心溫度降至-18 ℃時，將面團轉移至-18 ℃冰箱中進行凍藏備用。取樣時間分別為1、30、60 d。以不進行冷凍處理的面團為對照組。

1.2.2 面團處理方法

冷凍面團于25 ℃、相對濕度85%的恒溫恒濕箱中解凍，至面團中心溫度達25 ℃后，取部分樣品用于質構實驗、動態流變、蠕變及恢復性。另取部分解凍面團樣品于液氮中快速冷凍后，用ALPHA 1-2LD PLUS 真空冷凍干燥機進行真空冷凍干燥72 h，絕對真空度為3.7×10-5MPa，冷凍阱溫度-50 ℃，凍干后樣品采用MM400研磨儀粉碎，過60目篩，樣品粉末于4 ℃冷藏，用于蛋白質結構分析。

1.2.3 面團質構測定

將解凍后面團用TA-XT2i型質構儀測定面團的質構特性。實驗采用探頭：P/50鋁制圓柱形探頭；測定參數設置為：測前速度3 mm/s，測試速度1 mm/s，測后速度3 mm/s，壓縮比例70%，2次壓縮時間間隔10 s，觸發力10 g。每個樣品做6次重復，取平均值。本實驗中選擇硬度、彈性、黏附性、內聚性、咀嚼度作為質構評價指標。

1.2.4 面團動態流變學測定

參考Zhang等[14]的方法采用Physica MCR301型應變控制流變儀進行面團動態流變測定。測定模式為頻率掃描。具體操作為：選擇25 mm平行幾何平板，上下平板之間間隙2 mm。取待測面團約2 g置于底部平板，降下頂部平板后，刮去平板以外多余面團并在邊緣覆蓋一層硅油水分揮發，靜置10 min以避免其他外力干擾后開始測試。參數設定：應變恒定為0.05%(在LVR內)，頻率由0.1增大至100 rad/s，測定溫度恒定在25 ℃。所得頻率的掃描結果以頻率(rad/s)為橫坐標，G′或者G″為縱坐標作圖。

1.2.5 面團蠕變及恢復性測定

為測定面團受到外力后的形變抵抗力與恢復性，采用Physica MCR301型應變控制流變儀進行面團的蠕變及恢復性測定。具體操作與動態流變掃描操作相同。測試過程分為兩個階段：蠕變階段向面團施加50 Pa外力，作用300 s；恢復階段撤去外力，保持300s以使面團形變恢復。測試結束后可得到面團蠕變及恢復性曲線，利用儀器自帶RHEOPLUS/32軟件分析可得到一系列的參數：最大蠕變柔量Jmax，零切變黏度η0；瞬時蠕變柔量J0；遲滯蠕變柔量J1。

1.2.6 面團中游離巰基含量測定

參照Anderson等[15]的方法進行測定。

1.2.7 面團中谷蛋白大聚體含量測定

取250 mg凍干面團粉末加入23 mL質量分數1.5%的SDS-0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.9)，漩渦振蕩至粉末完全分散于液體后，在30 ℃下以1 000 r/min振蕩振蕩5min后，25 ℃ 11 600 g離心30 min，棄上清液，采用杜馬斯燃燒定氮儀測定沉淀中蛋白質含量，即為GMP近似含量。每個樣品做3次重復，取平均值。

1.2.8 面團中蛋白質二級結構測定

采用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)中對面團中蛋白質二級結構進行測定。稱取凍干面團粉末樣品2 mg，按照1∶100比例加入優級純溴化鉀作為稀釋劑，與樣品一起在瑪瑙研缽中充分研磨后壓片，10 kg壓力保持30 s，然后將制得的均勻透明薄片放入傅里葉變換紅外光譜儀中。圖譜掃描范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，信號掃描累加64次。每種處理的樣品重復測定3次。

圖譜處理：采用儀器自帶POUS 8.1 和Peak Fit 4.12 對圖譜進行分析處理。首先對所得原始吸收圖譜進行背景扣除水分、CO2氣體補償，然后對位于酰胺I帶(1 600～1 700 cm-1)的吸收峰進行基線校正、傅里葉自退去卷積、二階求導分析，使得疊加的各子峰得到分辨。根據二級結構對應峰面積占總峰面積的比例定量計算出二級結構含量。根據宋國勝[16]的方法，各個波長區間所對應的二級結構歸屬見表2。

表2 酰胺I帶經處理后各個條帶對應的二級結構歸屬

1.3 統計分析

采用Excel 2010 、Origin 8.0數據統計分析和圖表繪制。采用SPSS 19.0 中One-way ANOVA 程序進行方差分析。采用Duncan法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 凍藏時間對面團質構特性影響

凍藏時間對面團質構特性具有顯著性影響(表3)。隨著凍藏時間的延長，面團的硬度呈上升趨勢，彈性、內聚性和咀嚼度呈降低趨勢，而黏附性呈現先升高后降低的趨勢。凍藏1～30 d時，面團硬度、彈性、內聚性變化幅度較大，30～60 d時，面團質構特性繼續發生變化，但變化幅度減小，因此凍藏前30 d內面團質構變化最為明顯。凍藏1 d后面團黏附性略有增加，但隨著凍藏時間繼續延長，面團的黏附性呈現降低趨勢。這可能是因為長時間的凍藏使面團中的自由水含量減少，并且凍藏過程中水分不斷重結晶導致了面團中水分的重新分布，最終導致了面團黏附性的變化[7]。

表3 不同凍藏時間下解凍面團TPA指標值

2.2 凍藏時間對面團動態流變學特性的影響

凍藏時間對非發酵面團流變特性的影響如圖1所示。凍藏過程中，非發酵面團的彈性模量G′和黏性模量G″都隨著凍藏時間的延長而降低。這可能與面團中面筋蛋白結構以及與其他大分子物質之間作用力的改變有關。與凍藏1 d面團相比，面團凍藏至30 d時，彈性模量G′出現顯著降低；繼續凍藏至60 d時，彈性模量G′繼續下降，但下降幅度明顯減小。該結果與面團質構結果中彈性、內聚性變化規律相似。

圖1 不同凍藏時間對非發酵面團流變特性的影響

2.3 凍藏時間對面團蠕變和回復性的影響

蠕變及恢復性可以反映面團在實際加工過程中的宏觀性質，特別是面團在受到外力作用后的形變抵抗力和回復性。在蠕變階段，Jmax值越大，代表面團越柔軟；η0值越大，面團在外力撤去時的流動性越高，越難以保持形狀。在恢復階段，J0和Jm分別代表面團在恢復階段的彈性、黏性性能。由表4可知，隨著凍藏時間的延長，面團的最大蠕變柔量降低，零切變黏度不斷增加。與凍藏1 d面團相比，凍藏30 d面團的Jmax顯著降低，η0顯著增加，而凍藏30 d與凍藏60 d面團的Jmax、η0無顯著性差異。在恢復階段，J0與J1均發生下降，說明隨著凍藏時間的延長，面團受到外力后的恢復力下降，面團結構受到破壞。

表4 不同凍藏時間下面團蠕變恢復性曲線擬合后參數

2.4 凍藏時間對蛋白結構的影響

2.4.1 凍藏時間對游離巰基含量的影響

面團中的游離巰基可以用來表征面筋形成程度[17, 18]。凍藏時間對面團中游離巰基含量影響顯著(圖2)。與對照組面團相比，凍藏1、30、60 d面團中游離巰基分別上升了1.18、2.99、4.85 μmol/L。不同凍藏時間面團中游離巰基含量差異顯著。

圖2 不同凍藏時間面團中游離巰基含量

2.4.2 凍藏時間對谷蛋白大聚體含量變化

谷蛋白大聚體(GMP)與面團物理特性、面制品加工特性密切相關[19, 20]。面團品質的劣變與GMP的解聚有關[21]。凍藏過程中，面團中谷蛋白大聚體含量變化如圖3所示。隨著凍藏時間的延長，面團中谷蛋白大聚體含量不斷降低。與對照組面團相比，凍藏1、30、60 d面團中谷蛋白大聚體含量分別降低了0.41%、0.93%、1.35%。Graveland等[9]發現谷蛋白大聚體主要是通過二硫鍵交聯而成，面團中GMP含量的變化趨勢與游離巰基含量變化趨勢相吻合(圖2)，說明在凍藏過程中GMP是以二硫鍵斷裂的方式發生解聚，并且凍藏時間越長，GMP解聚程度越大，面團品質下降越明顯。Zhao等[22]認為谷蛋白大聚體的解聚可能是因為凍藏過程中冰晶不斷生長對面筋網絡結構造成破壞，而Bhatnager等[23]認為除了冰重結晶帶來的機械損傷外，長時間凍藏會導致濃縮和低溫效應，這也可能是導致GMP解聚的原因。

圖3 凍藏過程中面團中谷蛋白大聚體含量變化

2.4.3 凍藏時間對蛋白二級結構的影響

凍藏過程中面團中蛋白質二級結構變化如表5所示。Georget等[12]認為，蛋白二級結構的變化可以反映蛋白質聚集行為。面團由1 d凍至60 d的過程中，α-螺旋結構、β-轉角結構質量分數分別降低了3.69%、4.16%，β-折疊百分含量上升6.61%，而無規則卷曲變化無明顯規律。凍藏30 d時，β-折疊結構含量顯著上升，繼續凍藏后，盡管β-折疊結構含量繼續上升，但是上升幅度不顯著。這說明凍藏過程中，部分α-螺旋與β-轉角結構轉變成了β-折疊結構。可能是因為長時間的凍藏改變了面團內部的水合環境，冰晶生長產生的機械力作用破壞了維持α-螺旋和β-轉角結構的氫鍵，使二者形成小分子物質，隨著面團中自由水的不斷減少，這些小分子物質為達到能量最低的狀態來維持結構穩定發生重排形成了β-折疊結構[12, 24]。

表5 凍藏時間對面團中蛋白二級結構相對含量的影響

3 討論

凍藏過程中，面團硬度上升，彈性、內聚性下降，面團結構穩定性變差，受到外力后恢復性降低；通過分析面團中蛋白質結構發現，面團中游離巰基含量顯著增加，谷蛋白大聚體含量增加，二級結構中α-螺旋結構降低。根據前人研究[20]，面團物理特性的降低可能與面團中蛋白質聚合程度、二級結構α-螺旋降低有關，面團質地的變化與谷蛋白大聚體以及二硫鍵交聯程度相關。除此以外，面團形成過程中，小麥淀粉與蛋白質相互作用，促進了面筋網絡的形成，其中淀粉顆粒通過吸水膨脹支持與強化面團結構，凍藏過程中，淀粉發生重結晶，加快了淀粉的老化速率，淀粉顆粒出現凍裂現象[25, 26]，這也可能是面團特性發生改變的原因之一，還需要進一步研究證實。

隨著凍藏時間的延長，面團的硬度不斷增加，彈性、內聚性不斷降低，該結果與Bhattacharya[3]、Rashidi[5]、Gailkwad等[6]研究結果一致。葉曉楓[27]發現，面團彈性在凍藏至20 d時出現顯著降低(由0.92降至0.55)；Angioloni等[28]研究發現，對于面包面團來說，面團彈性在凍藏至30 d時出現明顯下降，但黏附性沒有明顯變化；而對于餅干面團來說，面團彈性在凍藏至45 d時出現明顯降低，但黏附性呈現持續增加的趨勢；但是Akbarian等[29]研究結果也得出，在56 d的凍藏期間，甜面團黏附性不斷降低。這說明，在凍藏期間，不同用途冷凍面團的質構特性變化上具有一定的差異，這可能與原料面粉中蛋白質、淀粉等大分子物質質量特性有關，也可能與面團制作過程中添加的配料不同有關。

對于面團的流變學特性，本研究中隨著凍藏時間的增加，面團彈性模量、黏性模量均不斷下降，并且在凍藏至30 d時彈性模量G′出現顯著降低。李杰平等[30]研究湯包皮面團流變特性則發現，在-18 ℃凍藏至21 d時，湯包皮的G′與G″均出現顯著降低，而在-30 ℃凍藏時，二者在凍藏至7 d時就已經出現了明顯的下降。葉曉楓等[27]也發現，凍藏至15 d，面團G″明顯降低，但凍藏至20 d時，面團G′才出現顯著降低。以上結果中，面團的流變特性都在凍藏30天內出現較為明顯的變化，因此該時間點可能是凍藏時間的關鍵控制點。

隨著凍藏時間的增加，面團中GMP含量不斷降低，游離巰基含量不斷增加。該結果與Wang等[31]研究結果一致。前人認為，冰晶的形成以及水分的遷移是GMP解聚的主要原因，但目前還沒有直接證據可以證明這一觀點。因此，凍藏過程中谷蛋白大聚體分子結構發生變化的具體機理還有待進一步研究。凍藏過程中，面團中蛋白質分子構象發生改變，主要由α-折疊、β-轉角向β-折疊轉化，姬成宇等[32]有類似的結論。李學紅等[33]研究了凍藏時間對麥谷蛋白二級結構的影響，雖然與本研究結論相似，但是麥谷蛋白凍藏至28 d時β-折疊增加了22%，而α-螺旋和β-轉角分別降低了12.5%、9.5%；王沛[34]則研究了凍藏時間對面筋蛋白二級結構的影響，結果顯示凍藏至30 d時β轉角與β-折疊分別上升了3.24%、6.74%，α-螺旋下降了10.47%。由此可見，凍藏對于蛋白二級結構的影響隨著面團體系的不同而存在明顯差異，但是在蛋白單體中變化程度更為明顯。這可能是因為面團是一個復雜的混合體系，其內部各種物質之間可能形成了更多的非共價鍵，從而使蛋白二級結構更加穩定，但這還需要進一步的研究驗證。

4 結論

凍藏時間對非發酵面團具有顯著影響；在凍藏過程中，面團硬度增加，彈性、內聚性、黏附性、咀嚼度降低；彈性模量G′與黏性模量G″均呈下降趨勢；面團在蠕變階段最大蠕變柔量Jmax降低，零切變黏度η0增加，恢復階段，瞬間蠕變柔量J0與遲滯蠕變柔量Jm均有所下降；面團中谷蛋白大聚體含量顯著下降，游離巰基含量顯著上升，蛋白二級結構由α-螺旋、β-轉角向β-折疊進行了轉變。總之，凍藏過程中非發酵面團品質不斷下降，并且在30 d內品質下降最為顯著。