西藏大花黃牡丹籽油的提取及品質(zhì)評價

鐘政昌 張超奇 仁增白瑪蘭小中闞金濤袁 雷

(西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院1，林芝 860000) (西藏森林資源天然產(chǎn)物研究中心2，林芝 860000) (西藏農(nóng)牧學(xué)院理化分析與生物技術(shù)中心3，林芝 860000)

大花黃牡丹(Paeonialudlowii)于1997年確立其分類學(xué)上的名稱[1]，為毛茛科芍藥屬落葉花灌木, 黃牡丹的一個亞種，為西藏特有植物，僅分布在海拔2 900～3 200 m 的雅魯藏布江藏布峽谷長約100 km的狹小范圍內(nèi)，是我國8個牡丹種之一[2-4]。李嘉玨等[2]經(jīng)調(diào)查研究認為大花黃牡丹與黃牡丹存在較大差異，大花黃牡丹應(yīng)該上升為種的等級。大花黃牡丹分布區(qū)面積不足10 km2，數(shù)量僅有6 000～7 000叢(株)，處于極度瀕危狀態(tài), 被《中國物種紅色名錄》收錄[5,6]。大花黃牡丹資源數(shù)量極少，研究主要集中在資源保護、擴繁栽培等工作[7-11]。近十年來，西藏植物學(xué)和藏藥資源學(xué)工作者、地方政府、地方企業(yè)聯(lián)合大力推動了大花黃牡丹擴繁工作，未來其資源量有望大幅提高。開展大花黃牡丹可持續(xù)性的開發(fā)利用研究，對服務(wù)地方經(jīng)濟及資源保護均有積極意義。

牡丹籽油富含α-亞麻酸,具有多種保健功能，近年掀起了研究熱潮[12-16]。2011年世界糧農(nóng)組織正式批準牡丹籽油列入食用油行列, 同年, 我國原衛(wèi)生部批準牡丹籽油為新資源食品, 2012年我國農(nóng)業(yè)部糧農(nóng)所把牡丹籽油列入食用油行列。目前國內(nèi)外學(xué)者對牡丹籽油的研究主要為提取工藝、理化性質(zhì)評價、脂肪酸分析、部分功效評價、油脂熱變性等[17-21],對大花黃牡丹籽油的研究極少，曾秀麗等[22]對西藏林芝和山南地區(qū)5個居群的混合種子以及2個居群的單株進行了5種脂肪酸含量分析，而大花黃牡丹籽含油量、提油技術(shù)、油脂品質(zhì)評價等方面鮮有報道。本研究根據(jù)GB/T 14488.1—2008測定大花黃牡丹籽含油量，建立提油技術(shù)并評價油脂品質(zhì)，為后期開發(fā)利用西藏大花黃牡丹提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡丹籽采自西藏林芝縣、米林縣等地，經(jīng)蘭小中教授鑒定為西藏大花黃牡丹的種子；脂肪酸甲酯系列標準品、α、β、γ、δ-生育酚標準品、甾醇標準品、角鯊烯標準品均為色譜純，石油醚、正己烷、氯仿、無水乙醚、氫氧化鉀、乙醇溶液、酚酞、鹽酸、韋氏試劑、碘化鉀、冰乙酸均為分析純。

RH-400KDE超聲波清洗器，LYNX4000高速離心機，GJ881-4電熱烘干箱，Sap分析天平，R-1001VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，Trace GC Ultra—DSQⅡ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1.2 方法

1.2.1 大花黃牡丹籽含油量的測定

按GB/T 14488.1—2008《植物油料含油量測定》方法測定。黃牡丹籽粒在烘箱中55 ℃烘干48 h至水分為(8.60±0.51)%，以剝殼前后粉碎至20～40目的牡丹籽(仁)粉為原料，精確稱取10.000 g樣品，用經(jīng)脫脂處理過的濾紙包好，放入索氏抽提器中，分別以石油醚和正己烷為提取溶劑，在抽提時間為1、2、3、4、5 h測定含油量。

1.2.2 大花黃牡丹籽油的提取

稱取15.000 g 大花牡丹籽仁粉末于圓底燒瓶中，按一定比例加入正己烷，置于超聲波清洗器中提取一定時間。抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除濾液中的正己烷，55 ℃下減壓干燥剩余物至恒重，準確稱重，按公式計算大花黃牡丹籽油的提取率。

式中：M1為接收瓶和大花黃牡丹籽毛油的總質(zhì)量/g;M2為接收瓶的質(zhì)量/g；M為大花黃牡丹籽仁粉末質(zhì)量/g。

1.2.3 提取工藝的優(yōu)化

單因素實驗：設(shè)定超聲溫度50 ℃、超聲功率120 W、樣品粒度40目、液料比8 mL/g，考察超聲提取時間10、20、30、40、50 min對出油率的影響；設(shè)定超聲提取時間40 min、超聲功率120 W、樣品粒度40目、 液料比8 mL/g，考察超聲溫度30、40、50、60、70 ℃對出油率的影響；設(shè)定超聲溫度50 ℃、超聲提取時間40 min，樣品粒度40目、液料比8 mL/g，考察超聲功率40、80、120、160、200 W對出油率的影響； 設(shè)定超聲溫度50 ℃、超聲提取時間40 min、超聲功率120 W、樣品粒度40目， 考察液料比4、8、12、16、20 mL/g對出油率的影響；設(shè)定超聲溫度50 ℃、超聲提取時間40 min、超聲功率120 W、液料比8 mL/g，考察粒度40、60、80、100、120目對出油率的影響。

正交設(shè)計：前期實驗表明，超聲提取時間、提取溫度、超聲波功率、液料比、樣品粒度大小對出油率均有不同程度的影響。為了減少實驗次數(shù)，并考察各因素之間交互作用對出油率的影響，擬采用L16(215)正交表進行實驗設(shè)計，見表1。在前期實驗中，觀察到超聲提取時間與液料比(AE)、超聲提取時間與樣品粒度(BD)、超聲波功率與液料比(CE)的相互作用很小，因此設(shè)置為空列。

表1 L16(215)正交設(shè)計

1.2.4 理化指標測定

碘價：參照GB/T 5009.299—2016《食品安全國家標準 食品中碘價的測定》；皂化值：參照GB/T 5534—2008《食品安全國家標準 食品中皂化值的測定》；過氧化值：參照GB/T 5009.227—2016 《食品安全國家標準 食品過氧化值的測定》；參照GB/T 5009.229—2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》；折光指數(shù)：用阿貝折光儀測定。

1.2.5 大花黃牡丹籽油微量活性物質(zhì)分析

生育酚的測定參照GB 5009.82—2016 《食品安全國家標準 食品中維生素 A、D、E 的測定》中維生素E測定方法進行；甾醇測定參照 GB/T 25223—2010；角鯊烯測定參照SNT 4785—2017中的氣相色譜-質(zhì)譜法。

1.2.6 大花黃牡丹籽油脂肪酸分析

脂肪酸的甲酯化：稱取樣品0.5 g置于50 mL離心管，加入5 mL正己烷、15mL 10%乙酰氯-甲醇溶液，瓶口封死，在80 ℃水浴反應(yīng)2 h，每隔20 min振搖1次，取出冷卻室溫，加入6%碳酸鈉10 mL，再加入5 mL正己烷，振蕩30 min，取出上清液過0.22 μm濾膜，濃度過高時再稀釋100倍后待測。

氣相色譜條件：色譜柱：HP-wax，30 m×0.25 mm，0.25 μm；進樣口溫度：270 ℃；程序升溫：初始柱溫40 ℃，保持1 min，以7 ℃/min升溫至210 ℃，保持 5 min，再以1.5 ℃/min升溫至240 ℃；載氣：高純氦(純度>99.999%)，流速：1.0 mL/min；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊電離源(EI)；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃；溶劑延遲：5 min；掃描方式：離子掃描(SIM)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應(yīng)用正交設(shè)計助手II3.11作正交實驗設(shè)計，并進行極差分析、方差分析和差異顯著性分析(P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著)；應(yīng)用SPSS18.0 軟件計算標準誤、單因素差異顯著性分析；應(yīng)用Origin8.0繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 大花黃牡丹籽含油量

由圖1可知，在1～3 h內(nèi)所有樣品的出油率明顯增加，石油醚的提油速度比正己烷快，3 h后2種溶劑的提油率無顯著差異(P>0.05)，5 h后2種溶劑的提油率基本一致。以5 h作為提取終點，以2種溶劑提油率作綜合計算，去殼樣品出油率為(39.51±1.04)%，帶殼樣品出油率為(28.26±1.22)%，此結(jié)果視為大花黃牡丹籽的含油量。去殼樣品與帶殼樣品之間出油率差異極顯著(P<0.01)，可能是果殼中部分脂溶性色素物質(zhì)溶出，使得帶殼樣品的油脂顏色明顯比去殼樣品的深。基于操作安全性考慮，后期實驗選擇正己烷作為提取溶劑。

圖1 提取溶劑和時間對大花黃牡丹籽出油率的影響

2.2 各因素對大花黃牡丹籽油提取率的影響

提高提取溫度可加劇溶劑和油脂的分子熱運動，提高擴散速率，從而提高出油率。由圖2 可知，在50 ℃時出油率達到最大值。處理溫度過高，正己烷揮發(fā)加劇，反而減少了正己烷與樣品的接觸面積，降低了擴散速率[23]，大花黃牡丹籽出油率反而下降。結(jié)果表明，50 ℃為適當(dāng)?shù)奶崛囟取?/p>

圖2 大花黃牡丹籽油單因素提取實驗結(jié)果

不同超聲提取時間對大花黃牡丹籽提油率的影響如圖2，在10～50 min內(nèi)，提油率隨超聲提取時間的增加而增加。超聲處理40 min 時出油率為37.10%，50 min時出油率為37.71%，兩者差異不明顯，原因是油脂在提取液和物料中的濃度達到了動態(tài)平衡，其出油率基本穩(wěn)定[24]。因此，最適超聲提取時間為40 min。

超聲波功率越大，其產(chǎn)生的機械作用和空化作用越劇烈，油脂滲透出來的速度就越快[25]。當(dāng)超聲功率過大，可能引起自由基降解脂肪酸組分，導(dǎo)致出油率增加緩慢甚至下降[26]。由圖2 可知，超聲波功率160 W時出油率最高。

減小原料的粒徑有利于提高植物油的提取率，油料破碎不完全時細胞結(jié)構(gòu)未被破壞，提取溶劑無法與完整細胞中的油接觸而不能充分地將細胞中的油提取出來[27]。粉碎粒度過小，原料的堆積密度增大，溶劑的擴散阻力增大，提取率反而下降[28]，圖2表明，樣品粒度為100目時提油率最高。

有效濃度差是油脂提取的主要推動力，因此大花黃牡丹籽出油率隨著液料比的增大而增加，液料比大于12 mL/g時，出油率的增加緩慢，再增大液料比對大花黃牡丹籽出油率的影響不明顯。可能是大花黃牡丹籽中油脂含量逐漸減少，有效濃度差小，再增加溶劑用量的作用甚微[25]。

2.3 正交優(yōu)化實驗結(jié)果

2.3.1 正交實驗因素水平

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，確定正交實驗各因素的水平如表2所示。

表2 正交實驗因素水平表

表3 L16(215)正交實驗結(jié)果

2.3.2 正交實驗結(jié)果與分析

由表3可知，根據(jù)R值大小可判斷出各因素和交互項對出油率的影響主次順序為：E→ED→BE→B=D→AC→BC→A=AB→AD→CD→C。E2>E1，E因素應(yīng)選E2；BE、ED交互作R值大于B、D項，B、D水平的選擇由BE、ED交互項決定,AC交互項R值分別大于A、C，A、C水平的選擇由AC決定，由表4和表5可知，應(yīng)選D2、A2、C2；表4中，在選擇E2的條件下，B1E2水平雖比B2E2水平略大，但比表3中B項中B2水平小，因此B因素應(yīng)B2水平。各因素對提油率最優(yōu)組合為：A2B2C2D2E2,即處理溫度60 ℃、超聲提取時間50 min、超聲功率160 W、樣品粒度100目、液料比12 mL/g。

表4 AC、ED、EB二元表

2.3.3 優(yōu)化實驗驗證

以2.3.2得到的優(yōu)化組合，即處理溫度60 ℃、超聲提取時間50 min、超聲功率160 W、樣品粒度100目、液料比12 mL/g，進行3次實驗，提油率為(38.24±0.63)%，優(yōu)于正交設(shè)計的結(jié)果。

2.4 大花黃牡丹籽的理化性質(zhì)

由表6可知，正已烷與石油醚提取的大花黃牡丹籽油的碘價、酸價、皂化價、過氧化值差異不顯著(P>0.05)，碘值的高低與油脂中不飽和雙鍵的多少有關(guān)，雙鍵的數(shù)目越多碘值就越高，說明大花黃牡丹籽油不飽和程度大，對人體的健康較有利；酸價是一種脂肪中游離脂肪酸含量的指標，酸價越小，說明油脂質(zhì)量越好，這一特性將有利于大花黃牡丹籽油后期的精煉工藝；皂化值表示油脂中脂肪酸相對分子質(zhì)量的大小，皂化值越大，脂肪酸相對分子質(zhì)量越小，大花黃牡丹籽油皂化值在藥典規(guī)定的注射用油皂化值185～200 mgKOH/g 范圍內(nèi)；大花黃牡丹籽油過氧化值小于1.56 mmol/kg，遠低于國家標準限量值，說明本實驗所提取的油中雙鍵被氧化程度低。總體上，大花黃牡丹籽油理化指標均符合LS/T 3242—2014《牡丹籽油》。所用的 2 種溶劑中，正己烷提取出油率高，油脂色澤和透明度、碘價、酸價、皂化價等指標與石油醚提取差異小，操作安全性優(yōu)于石油，為大花黃牡丹籽油的理想溶劑。

表5 正交實驗方差分析

表6 大花黃牡丹籽與其他牡丹籽油脂理化性質(zhì)比較

與相關(guān)文獻相比較，發(fā)現(xiàn)大花黃牡丹籽油的碘價略低于各地各類牡丹籽油，與湖南湘西的野生牡丹籽油基本一致；酸價、過氧化值與滇牡丹籽油接近，除高于湖南湘西的野生牡丹籽油外，明顯低于其他牡丹籽油；皂化價與各地各類牡丹籽油的差異小；折光指數(shù)略小于其他牡丹籽油[29-32]。總體上，西藏大花黃牡丹籽油的理化特性與滇牡丹籽油、湘西野生牡丹籽油較接近，均屬于優(yōu)質(zhì)油脂。

2.5 大花黃牡丹籽油的部分功能成分

分別檢測了大花黃牡丹籽油中角鯊烯和VE部分甾醇含量，結(jié)果見表7。

表7 大花黃牡丹籽油的部分微量活性物質(zhì)含量

從表7可知，大花黃牡丹籽油中VE總含量達550.27 mg/kg，以γ-生育酚為主。經(jīng)典理論認為α-生育酚是活性最高，營養(yǎng)效價最好的VE，而近年來一些研究表明,γ-生育酚可能是VE實際上的心血管保護成分,并有抗癌和防癌作用[33]，因此大花黃牡丹籽的保健作用值得深入研究；在大花黃牡丹籽油中檢測到β-谷甾醇4.94 μg/mL，巖藻甾醇4.33 μg/mL，角鯊烯153.67 μg/mL，與內(nèi)地牡丹籽油相比，甾醇含量偏低，而角鯊烯則高出2～4倍[34]。

2.6 大花黃牡丹籽油的脂肪酸分析

經(jīng)過GC-MS檢測分析得到脂肪酸甲酯標準品總離子流圖和大花黃牡丹籽油樣品離子流圖，見圖3。大花黃牡丹籽油樣品檢測出20種脂肪酸，見表8，其中飽和脂肪酸為14種，單不飽和脂肪酸3種，多不和脂肪酸為3種。依據(jù)峰面積歸一化法計算，棕櫚酸(9.31%)、油酸(41.03%)、亞油酸(16.02%)、α-亞麻酸(29.90%)是大花黃牡丹籽油的主要脂肪酸成分。油脂以不飽和脂肪酸為主，相對質(zhì)量分數(shù)87.44%，其中多不飽和脂肪酸相對質(zhì)量分數(shù)為46.04%。α-亞麻酸具有降低血脂及膽固醇，促進脂肪代謝及肝細胞再生等功效，被譽為“植物腦黃金”。普通的牡丹籽油中α-亞麻酸質(zhì)量分數(shù)在32%以上[35]，西藏大花黃牡丹籽油α-亞麻酸含量比普通牡丹籽油低，而西藏大花黃牡丹籽含油量比普通牡丹籽高。

表8 大花黃牡丹籽油主要脂肪酸組成

本實驗對大花黃牡丹籽油脂肪酸的分析結(jié)果與曾秀麗等[22]的分析結(jié)果相近，證明了西藏大花黃牡丹籽油與普通牡丹籽油的脂肪酸在組成與含量上均有較大的差別。西藏大花黃牡丹籽油主要脂肪酸中，油酸>α-亞麻酸>亞油酸>棕櫚酸>硬脂酸，而多數(shù)普通牡丹籽油α-亞麻酸含量最高，通常是亞麻酸>亞油酸>油酸>棕櫚酸>硬脂酸。大花黃牡丹籽油是優(yōu)質(zhì)的 ω-3保健食用油，在醫(yī)藥工業(yè)、高級化妝品、高級潤滑油等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

西藏大花黃牡丹籽去殼樣品含油量為(39.51±1.04)%，帶殼樣品含油量為(28.26±1.22)%；通過L16(215)正交設(shè)計優(yōu)化提取工藝，得到最佳提取工藝為處理溫度60 ℃、超聲提取時間50 min、超聲功率160 W、樣品粒度100目、液料比12 mL/g。在此工藝條件下大花黃牡丹籽的出油率為(38.24±0.63)%，占大花黃牡丹籽含油量的97%，說明正交設(shè)計優(yōu)化結(jié)果適合于大花黃牡丹籽油提取工藝，為西藏大花黃牡丹籽油規(guī)模化提取工藝提供了參考。2種溶劑提取的大花黃黃牡丹籽油理化指標均符合LS/T 3242—2014要求并處于優(yōu)質(zhì)水平。正己烷提取的大花黃牡丹籽油中檢測出以γ-生育酚為主的VE總含量550.27 mg/kg，β-谷甾醇4.94 μg/mL，巖藻甾醇4.33 μg/mL，角鯊烯153.67 μg/mL。牡丹籽油中含20種脂肪酸組分，主要由亞麻酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸組成，其中亞麻酸占總脂肪酸含量的29.90%。大花黃牡丹籽油中含不飽和脂肪酸6種，占其脂肪酸總量的87.44%，其中單不飽和脂肪酸3種，占41.40%，多不和脂肪酸為3 種，占46.04%，飽和脂肪酸占其總量的12.56%。