香榧籽油金松酸的分離及其1,3-甘油二酯的制備研究

孟祥河 楊奇波 肖 丹 夏朝盛 樊律廷宋麗麗 吳家勝

(浙江工業大學食品科學與工程學院1，杭州 310014) (浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室2，杭州 311300)

香榧，作為名貴干堅果有著上千年的食用歷史，是國家衛生部首批批準的藥食兩用的食物之一，具有很高的藥用和食用價值[1-2]。香榧籽仁含油量較高，為40.39%～52.80%，其中不飽和脂肪酸約占總脂肪酸的87%，主要為油酸、亞油酸，以及特殊結構的5-亞甲基間隔不飽和脂肪酸——金松酸(5,11,14-20∶3; SCA)[3-4]。

SCA主要分布在裸子植物種子中，是榧籽油的特征性脂肪酸[5-6]。研究表明，金松酸具有控制血脂、抗炎等諸多生理功效[7-11]。目前關于金松酸的研究主要集中在生理活性方面，由于金松酸來源少、含量低，不易獲得高含量的產品，因此關于SCA的利用研究鮮有報道。結構脂質通過調整甘油碳骨架上功能性脂肪酸的種類及位置，實現特定的理化性質與生理活性。典型的結構脂質，甘油二酯有1,2-DAG和1,3-DAG兩種異構體，少量地存在于天然油脂中[12-13]。1,3-DAG由于其結構的特殊性，在體內難以再合成TAG，因而有防止肥胖、降低餐后血脂含量、防治高血脂、高血壓、心腦血管病等生理活性和功能[14-17]。如果結合SCA特殊的生理活性合成富含SCA的1,3-DAG可以兼備二酯與脂肪酸本身的生理功能，對開發新型的功能性脂質、改善人體健康將具有重要而積極的意義[18]。DAG的制備方法主要有直接酯化法、甘油解法和部分水/醇解法。甘油解法和部分水解法都是從油脂直接出發，特定脂肪酸富集選擇性不高。榧籽油中的SCA起始質量分數為9.45%～14.28%，要制備富含SCA的1,3-DAG，預純化SCA是必要的。

本研究以榧籽油為原料，制備穩定性好、沸點低、易分離的榧籽油混合脂肪酸乙酯(FAEE)，同時采用尿素包合法富集FAEE的SCA乙酯。通過高1,3-位選擇性的脂肪酶催化高濃度的SCA乙酯與甘油反應生物合成富含SCA的1,3-DAG，并對產物脂肪酸的組成進行表征，初步實現了榧籽油功能性SCA的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

正己烷、30～60 ℃石油醚、37%濃鹽酸、甘油、乙醇鈉、200～300目硅膠、HPLC級正己烷、異丙醇、甲酸、0.4～0.5 mm硅膠板；亞油酸乙酯、甘油酯：標準品。

Agilent 7890A氣相色譜儀，Waters1525液相色譜儀，Waters 2414示差檢測器，Agilent Poroshell-120液相色譜柱。

1.2 實驗方法

1.2.1 榧籽油制備

榧籽剝殼，粉碎機進行粉碎后過40目篩子后以1∶4的料液比向榧籽粉末中加入正己烷，在超聲中對榧籽粉末進行20 min的兩次浸提，浸提液真空抽濾后旋轉蒸發獲得榧籽油。

1.2.2 榧籽油的脂肪酸組成分析

脂肪酸甲酯制備參照GB/T 17376—2008標準方法[19]。取0.1～0.2 g榧子油于50 mL燒瓶中，加入2粒沸石，再加入4 mL 0.5 mol/L的氫氧化鈉甲醇，于75 ℃下水浴回流15 min后加入55%的三氟化硼甲醇絡合物5 mL，繼續回流2 min，加入2 mL色譜純正己烷，1 min后加入15 mL飽和氯化鈉溶液振蕩15 s，轉入50 mL容量瓶中，加入足夠飽和氯化鈉至容量瓶分層，加5 mL色譜純正己烷萃取FAME。取正己烷相經無水硫酸鈉干燥，適當稀釋，GC分析。

氣相色譜法(GC)條件：sp-2340色譜柱(60 m×0.25 mm×0.2 μm)，載氣為高純N2，流速20 mL/s，進樣口溫度230 ℃，FID溫度220 ℃，分流比100∶1；進樣量1 μL；185 ℃恒溫40 min。

1.2.3 醇解制備榧籽油混合乙酯

取一定量的香榧油溶解于過量無水乙醇中，加入過量的乙醇鈉，55 ℃下磁力攪拌一定時間后，反應混合物轉移至分液漏斗，靜置分層。取上相乙酯層，加入占上相體積20%的60 ℃的蒸餾水洗滌3次，最后加入5% 的HCl溶液洗滌以去除乙酯中殘留的堿與皂[20]。

1.2.4 脂肪酸乙酯的含量測定

準確稱取約100 mg的醇解產物混合物，添加4 mg的十九酸甲酯，用石油醚∶乙醚=95∶5作為展開劑進行TLC層析，刮下乙酯條帶用正己烷溶解后進行GC分析。脂肪酸乙酯總量用下式計算:

式中：M總為總FAEE質量，mg；MC19為十九酸添加量，mg；AC19為十九酸甲酯的氣相峰面積；A總為所有脂肪酸酯的峰面積之和。

1.2.5 HPLC法分析反應產物甘油酯組成

取約150 mg的反應產物，用流動相定容到10 mL容量瓶備用。HPLC法，檢測條件如下： Waters 2410示差折光檢測器，流動相為含0.1%的甲酸的正己烷/異丙醇(20∶1)混合溶液，流速1 mL/min，柱箱溫度35 ℃，進樣量10 μL。各組分通過對比1,3-二油酸甘油酯，1,2-二油酸甘油酯以及TLC分離得到的純品的保留時間確定，含量用峰面積歸一化法計算。其中TAG、1,3-DAG、1,2-DAG和MAG純品通過TLC法得到：取反應后產物用正己烷-乙醚-甲酸(70:30:1)在制備硅膠板上分離，以碘顯色，各條帶刮下后TAG以正己烷萃取，1,3-DAG、1,2-DAG和MAG以乙醚萃取，分別保存。

1.2.6 尿素包合法富集金松酸乙酯

取尿素溶解于95%乙醇中至濃度40%，在70 ℃下磁力攪拌回流直至尿素完全溶解。分別按5∶1～1∶1酯脲比添加混合FAEE，連續回流2 h，混合物在25 ℃的自來水中冷卻30 min，然后4 ℃靜置12 h。結晶后的尿素-脂肪酸乙酯混合物趁冷迅速過濾，并用尿素飽和的95%乙醇溶液洗滌濾渣，收集濾液轉移至分液漏斗，加入20%體積分數的5% HCl溶液，再加入等體積的正己烷進行萃取。下層水相如上重復萃取2次，合并正己烷萃取相，用20%的蒸餾水洗滌，旋轉蒸發正己烷相得到富集SCA的乙酯，稱重。取約50 mg的包合后乙酯，溶于10 mL色譜級正己烷，微濾后GC分析，計算金松酸乙酯及回收率。

式中：P1為包合后金松酸純度；m1為包合后乙酯質量；P0為初始榧籽油金松酸含；m0為包合前乙酯質量。

1.2.7 酶促酯交換反應合成1,3-DAG的研究

甘油的吸附：將硅膠與甘油1∶1混合，攪拌直至甘油被硅膠完全吸附，形成“干燥”粉末。

酯交換反應：按FAEE、甘油摩爾比 2∶1稱取SCA乙酯混合物、硅膠吸附的甘油，磁力攪拌混合，水浴加熱至既定溫度，加入乙酯質量5%的固定化酶開始酯交換反應。固定間隔時間取樣，用于TLC、GC、HPLC分析，計算酯化率，SCA及1,3-DAG含量。

2 結果與討論

2.1 香榧籽油的醇解

SCA以甘油三酯的形式存在于榧籽油中，純化富集前將其轉化為游離脂肪酸(FFA)或脂肪酸乙酯(FAEE)是必要的。本研究通過酯交換反應，即乙醇鈉催化TAG和過量乙醇進行酯交換反應制備FAEE。與酸催化酯交換反應相比堿催化具有溫度低(50～70 ℃)，速度較快(1～3 h)、轉化率高(>90%)等優點[21-23]。55 ℃條件下乙醇鈉催化不同比例醇油比例混合物反應1 h產物乙酯含量如圖1所示。

注：反應溫度55 ℃、催化劑為乙醇鈉，添加量為總混合物重量的1%，反應時間1 h。圖1 香榧籽油在不同乙醇/油比例條件下的醇解度

通常來講，過量乙醇有助于酯交換反應平衡向乙酯生成方向轉化，促進TAG醇解更徹底。圖1顯示，醇油體積比為0.25∶1(摩爾比為4.25∶1)時，乙酯濃度最高為93.8%。然而催化劑濃度不變，隨醇油比增加乙酯純度有所下降。醇油比15∶1時，乙酯產率僅為67.3%。這可能是因為過多的乙醇導致香榧油濃度降低，與催化劑分子的碰撞次數減少，因而有限的時間內榧籽油醇解不充分。傅紅等富集魚油時也有類似的發現，其認為要TAG充分醇解，醇油摩爾比不高于4.8是必要的[24]。當醇油比固定在0.25∶1,反應2 h醇解度從93.8%增大到97.8%，進一步延長時間至3 h，5 h, 醇解度改變不明顯，表明反應達到了動態平衡。因此后續反應采用0.25∶1的醇油比在55 ℃下反應2 h制備香榧籽油FAEE。

2.2 尿素包合富集金松酸乙酯

醇解得到的混合FAEE，實驗采用尿素包合法純化SCA。尿素包合過程中尿素濃度、包合溫度、包合時間和酯脲比都會對最終目標脂肪酸的純度有所影響，其中酯脲比最為重要[25]。為盡可能地富集并回收香榧籽油SCA，實驗確定尿素濃度為40%，溶解溫度70 ℃，包合時間2 h。不同酯脲比條件下香榧油FAEE包合效果如圖2所示。產物的脂肪酸組成見圖3。

圖2 酯脲比對木榧油金松酸乙酯的包合效果

注：A包合前混合脂肪酸乙酯, B～F酯脲比分別為 0.2、0.3、0.35、0.4、0.5。圖3 不同酯脲比包合香榧油乙酯的GC圖

顯而易見，脂脲比對包合效果影響顯著。當脂脲比為0.2時，包合產物中金松酸乙酯的純度最高，達78%，金松酸乙酯的回收率為36.4%。脂脲比提高到0.3，0.35時，金松酸乙酯的純度略有下降，分別為73.0%、63.8%。脂脲比為0.4時金松酸乙酯回收率高達98.6%，但金松酸乙酯純度卻降低至46.9%。0.3和0.35的酯脲比包合，金松酸乙酯的純度相差不多，但金松酸乙酯的回收率從43.0%顯著增加到87.0%。呂秋楠[27]和魯仲輝[26]等研究尿素包合法富集亞麻酸時亦有類似的發現。因此綜合考慮SCA純度、回收率以及經濟性，脂脲比0.35包合木榧油乙酯是適宜的。

2.3 固定化脂肪酶無溶劑體系中催化FAEE、甘油合成1,3-DAG

以純化的金松酸乙酯和甘油為起始原料，研究探討了Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM及Novozyme 435的催化效果。不同溫度下的轉酯化反應時間進程曲線如圖4所示。

與Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM相比Novozym 435催化活性高，5～8 h后1,3-DAG即達到最大產率。隨溫度增加，Novozym 435催化活力明顯加快。50 ℃和60 ℃反應5 h，1,3-DAG產率分別為30.1%和42.5%，而40 ℃時，反應速率較低， 8 h后1,3-DAG產率達到最高(26.8%)。時間繼續延長1,3-DAG產率略有下降，且反應趨向平衡。 Zeng[28]等在油酸與甘油合成1,3-DAG的研究中也有類似的發現。這可能是隨著反應時間的延長，偏甘酯發生酰基轉移進一步與EE反應生成了TAG，1,3-DAG的含量從而降低。此外，也和Novozym 435不十分嚴格的1,3位置專一性有關[29-30]。Lipozyme TL IM催化選擇性可接受，但活力較低，而且其熱穩定性較差，最適溫度為50 ℃，反應24 h后1,3-DAG產率不足30%。

Lipozyme RM IM因在各種介質中(無溶劑、有機溶劑，超臨界流體等)均表現出良好的的活性和穩定性，因此廣泛應用于油脂改性[31]。與Novozym 435類似，隨溫度增加Lipozyme RM IM活力上升明顯，60 ℃為其最適溫度。不同的是，因其位置選擇性高，隨時間延長1,3-DAG產率逐漸增。Luis Vázquez[32]等以混合脂肪酸乙酯為原料，在65 ℃下與甘油以2∶1摩爾比反應，DAG得率為60.7%，1,3-DAG得率為39.8%。李磊[30]等研究米糠油甘油解制備1,3-DAG時發現60 ℃是Lipozyme RM IM的最佳溫度，溫度高于60 ℃時，DAG產量開始下降。Zhong[33]采用Lipozyme RM IM催化月桂酸、甘油酯化反應合成1,3-DAG，當酶添加量為5%，月桂酸和甘油摩爾比為2∶1，50 ℃下反應3 h，1,3-二月桂酸酯得率為80.3%。Watanabe T等[34]也報道了Lipozyme RM IM在無溶劑體系中催化混合脂肪酸與甘油合成DAG的表現。5%的酶添加量，50 ℃下反應4 h，DAG產率達84.0%，純度為90.0%。然而酯化反應所用的游離脂肪酸制備需耗用大量的酸堿，環境問題突出。本研究采用5% Lipozyme RM IM做催化劑，FAEE、甘油摩爾比2∶1，60 ℃反應24 h，產物中1,3-DAG產率達55.5%。

2.4 合成產物中的成分組成

三種脂肪酶不同溫度下催化酯交換反應的選擇性如圖5所示。產物的脂肪酸組成見表1。甘油酯產物中1,3-DAG與1,2-DAG的比例反應了酶催化位置選擇性的強弱。1,3-DAG/1,2-DAG比例越大，1,3-DAG含量越高，產物生理活性越高。圖5顯示，溫度升高后各脂肪酶合成產物中1,3-DAG/1,2-DAG的比例都增大，這與我們從前的的發現接近[35]。這可能是因為高溫促進了1,2-DAG的Sn-2位脂肪酸向Sn-3位酰基轉移，轉化為熱穩定性更高的1,3-DAG[36]。因此在適當范圍內提高反應溫度不僅能夠提高1,3-DAG的合成速率和產率，同時也能夠調整并改善二酯的比例。此外，數據也顯示3種酶的1,3-位置選擇性由強到弱依次為Lipozyme TL IM>Lipozyme RM IM>Novozym 435。Novozym 435的特異性最低，因此反應后期乙酯與偏甘酯繼續反應生成TAG，而Lipozyme RM IM和Lipozyme TL IM具有較高的位置特異性，脂肪酸因此很少結合在Sn-2位上，很難再合成TAG。

圖5 不同溫度下脂肪酶催化酯交換反應產物中的1,3-DAG/1,2-DAG的比例

制備1,3-DAG過程中，原料油、混合FAEE、包合富集的SAC乙酯以及不同脂肪酶最適條件下催化制備得到1,3-DAG的脂肪酸組成列于表1。結果顯示1,3-DAG的脂肪酸組成與包合富集的SAC乙酯原料無顯著差別，表明三種脂肪酶沒有表現出明顯的脂肪酸選擇性。1,3-DAG中SCA含量在58.6%～59.8%之間，符合預期。

表1 三種酶合成的1,3-DAG的脂肪酸組成

3 結論

采用乙醇鈉催化香榧油醇解高效、時間短，得到FAEE可方便地采用尿素包合法一步富集得到純度為60%～73% SCA乙酯。Lipozyme RM IM活力高、1,3-位置選擇性強是催化SCA乙脂、甘油轉酯化反應最適合催化劑。當添加量5%，乙酯、甘油摩爾比2∶1, 60 ℃反應24 h，1,3-DAG產率達55.5%，其中金松酸質量分數為58.6%。實驗開發的化學-酶催化兩步制備1,3-DAG的技術路線具有經濟、高效、工藝綠色等優點，具有一定的商業化潛力。