臭氧水協同超聲波處理對小麥中DON降解效果的研究

楊 龍 關二旗 楊玉玲 李萌萌 卞 科

(河南工業大學糧油食品學院，鄭州 450001)

小麥赤霉病是一種由多種鐮刀菌引起的世界性流行病害，多發于氣候溫潤多雨的溫帶地區，在我國流行區域主要集中在東北春麥區和長江中下游冬麥區[1]。小麥揚花期時多為溫暖多雨天氣，為赤霉病病菌侵染提供了有利環境條件，使我國成為世界上麥類赤霉病發生頻率最高、受影響最大的國家之一[2]。赤霉病不僅造成小麥產量損失和品質的下降，更為重要的是嚴重影響食品安全，對人畜有較大的危害[3, 4]。因此，設法降解赤霉病小麥中的真菌毒素，在保障消費者健康、減少經濟損失、加快該產業的健康快速發展等方面具有重大的經濟意義和社會意義[5]。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌等真菌侵染谷物后所產生的次級代謝產物，是赤霉病小麥中最主要的真菌毒素，DON具有很強毒性，人誤食含有嘔吐毒素的食物后，常會引起四肢無力、頭昏、發熱、腹脹、腹瀉和嘔吐等癥狀，動物對嘔吐毒素具有一定的敏感性。嚴重影響人畜健康[6, 7]。隨著赤霉病在世界范圍內的蔓延，國內外學者對DON的削減方法進行了大量的研究和探索。目前，關于DON的削減技術主要集中在物理法、化學和生物方法上，其中物理方法主要包括小麥加工(清洗、分選、研磨[8, 9])、熱處理(過熱蒸汽[10]、焙烤[11])、輻照(紫外光[12]、60Co-γ射線[13]和微波誘導[14])和吸附[15]等；化學方法包括SO2[16]和Na2CO3[17, 18]等；生物法包括利用酶(嘔吐毒素糖基化酶[19]等)、微生物(米曲霉[20]、乳酸菌[21]、放線菌[22]、腸桿菌[23]等)將毒素代謝為無毒產物等。無論物理方法、化學方法還是微生物方法均存在一定的缺陷，如物理方法脫毒效果差、影響小麥品質等；化學方法可能有化學物質的殘留或產生新的有毒物質；生物法工藝難度大、見效周期較長、經濟成本過高、可能產生有害物質等，因此尋找更為安全有效的DON降解方法迫在眉睫。為解決現有技術手段存在的問題，目前大量研究紛紛轉向兩項或多項技術的聯合處理，提高有機物的降解率[24]。

臭氧(O3)因其具有極強的氧化性，而且無毒性殘留，已被普遍認為是一種安全、可直接應用于食品加工的處理手段[10]。近年來，國內外研究者就臭氧氣體[25, 26]或臭氧水[27]對小麥籽粒和全麥粉中DON降解效果進行大量研究，但單獨臭氧處理存在臭氧濃度過高、費用高、礦化程度低和利用率低等缺點，因此有研究者將其與其他技術聯合使用，以獲取更好的降解效果和經濟效益。超聲波具有特殊的物理化學效應，特別是超聲空化所產生的高溫、高壓，為有機物的化學反應提供了極端的物理化學環境[28]。超聲波技術具有操作和控制容易，在處理中不引入其他的化學物質，且反應條件溫和、反應速度快等優點，應用前景廣闊[29]。有研究者將超聲波技術與臭氧結合，進行食品保加工[30, 31]、污水處理[32, 33]、農殘降解[34]等處理。但是，采用臭氧水協同超聲波聯合降解DON的研究卻鮮有報道。因此，本研究采用臭氧水協同超聲波處理赤霉病小麥，探究不同協同處理方式對DON降解的規律，并確定臭氧水協同超聲波處理赤霉病小麥籽粒降解DON 的最佳工藝條件，為臭氧水協同超聲波處理在DON降解中的應用提供更多理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霉病小麥：河南省南陽市；DON 純品(純度≥99%)、乙腈(色譜級)、乙腈(分析級)、甲醇(色譜級)、甲醇(分析級)、超純水。

1.2 儀器與設備

SFX 20:0.55超聲波破碎儀，COM-AD-01高濃度臭氧發生儀，JSA9-O3-UV便攜式紫外臭氧檢測儀，SFX 20:0.55超聲波細胞破碎儀,Waters e2695液相色譜儀,12165001B BEM多功能凈化柱,Centrifuge 5810R高速離心機,MTN-2800D氮吹濃縮儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 臭氧水的制備

打開臭氧發生器，待設備穩定后，開啟氧氣罐閥門，制備的臭氧通過鼓泡法直接通入常溫的超純水中獲得臭氧水，通過控制通氣時間和氣體流量獲得不同濃度的臭氧水。臭氧水濃度的測定參考郝淑賢等[35]的方法。

1.3.2 不同聯合處理方式對小麥中DON的降解效果影響

將25 g經清理除雜的小麥樣品置于400 mL燒杯中，處理總時間為10 min。在臭氧水濃度為58.32 mg/L、超聲振幅為50%條件下，研究臭氧水和超聲波聯合處理的方式，分別采用單一、串聯、先單一后并聯、先并聯后單一和并聯的方式研究對小麥中DON的降解效果，確定最佳處理方式。如表1所示，小麥籽粒具體處理方法如下：T1，未進行任何處理的赤霉病小麥籽粒；T2，單一處理實驗，超聲波(超純水)處理10 min；T3，單一處理實驗，臭氧水浸泡處理10 min；T4，串聯實驗，先臭氧水后浸泡5 min，后超聲波(超純水)處理5 min；T5，串聯實驗，先超聲波(超純水)處理5 min，后臭氧水后浸泡5 min；T6，先臭氧水后浸泡5 min，后超聲波(臭氧水)處理5 min；T7，先超聲波(臭氧水)處理5 min，后臭氧水后浸泡5 min；T8，聯合處理，臭氧水浸泡與超聲波處理同時進行10 min。每個處理進行三組平行實驗。

表1 不同臭氧水和超聲波聯合處理方式的設置

1.3.3 臭氧水協同超聲波處理對小麥中DON的降解效果影響

處理方式確定后，分別研究臭氧水濃度、超聲振幅和處理時間比(超聲波處理時間與臭氧水處理時間的比值)三個因素對小麥中DON降解效果的影響。每個處理設置三個平行。

1.3.3.1 不同臭氧水濃度小麥中DON的降解效果影響

將25 g經清理除雜的小麥樣品置于400 mL燒杯中，處理總時間為10 min，在超聲振幅為50%、處理時間比為5∶5條件下，先加入75 mL超純水后超聲波處理5 min，倒盡水后再加入75 mL臭氧水浸泡5 min，臭氧水濃度分別為14.58、29.16、43.74、58.32 mg/L，對照組未經任何處理。處理完后，將小麥籽粒放入40 ℃烘箱中烘干，4 ℃下儲存備用。烘干后小麥水分含量測定參照GB/T 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》。

1.3.3.2 超聲振幅對小麥中DON的降解效果影響

將25 g經清理除雜的小麥樣品置于400 mL燒杯中，處理總時間為10 min，在臭氧水濃度為58.32 mg/L、處理時間比為5∶5條件下，先加入75 mL超純水后超聲波處理5 min，倒盡水后再加入75 mL臭氧水浸泡5 min，超聲振幅分別設定為10%、30%、50%、70%，對照組未經任何處理，其余步驟同上。

1.3.3.3 處理時間比對小麥中DON的降解效果影響

將25 g經清理除雜的小麥樣品置于400 mL燒杯中，處理總時間為10 min，在超聲振幅為50%、臭氧水濃度為58.32 mg/L條件下，先加入75 mL超純水后進行超聲波處理，倒盡水后再加入75 mL臭氧水進行浸泡處理，處理時間比分別設定為1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1，對照組未經任何處理，其余步驟同上。

1.3.4 正交優化降解小麥中DON工藝參數

在以上單因素實驗的基礎上，進行正交實驗，選擇L9(34)正交表對臭氧水濃度、超聲振幅和處理時間比3個因素進行優化，以確定DON降解的最佳條件，因素與水平表見表2。

表2 正交實驗因素與水平設計表

1.3.5 DON的測定

DON的提取、凈化參照Liu Yuanxiao等[10]的方法。利用高效液相色譜法對 DON進行定量檢測，檢測方法參考Li Mengmeng等[36]的研究。

DON降解率的計算：

DON降解率=(1-CA/C0)×100%

式中：CA為小麥樣品經不同方式處理后DON的濃度/mg/kg；C0為小麥樣品中DON的初始濃度/mg/kg。

1.4 數據統計與分析

每個實驗指標重復測定三次，測定的數據通過Excel 2010處理，并用SPSS 20進行顯著性(P<0.05)分析。

2 結果與分析

2.1 DON標準曲線的繪制

由圖1可知，DON標準溶液在0.1～10 μg/mL濃度范圍內，DON質量濃度與色譜峰面積呈現良好的線性關系，方程表達式為y=1.84×104x-2.69×102，相關系數R2為0.999 9，表明該標準曲線能夠對待測樣品中DON含量進行準確定量。

圖1 DON溶液標準曲線

2.2 不同臭氧水和超聲波聯合處理方式對小麥中DON降解效果的影響

在相同的臭氧水濃度和超聲振幅下(58.32mg/L，50%)，研究不同的處理方式對小麥中DON降解效果，分別采用了單一、串聯、并聯以及混合聯合的方式處理小麥，總處理時間為10 min，結果見表3。

表3 不同臭氧水和超聲波聯合處理方式對小麥中DON降解效果的影響

比較表3中的處理方式可知，當采用T6(先臭氧水處理5 min再聯合處理5 min)DON降解效果最差，降解率顯著低于其他處理方式(P<0.05)；并聯方式T8(超聲波和臭氧水協同處理10 min)DON降解率與單一方式T3(臭氧水處理10 min)無顯著性差異(P>0.05)。這可能是因為超聲波促進臭氧分解產生更多·OH自由基，同時也會加快臭氧水中臭氧分子的溢出，導致對DON的降解效果并不明顯[34]。同樣是串聯處理方式，T4(先臭氧水處理5 min后再超聲波處理5 min)的DON降解率顯著降低T5處理(P<0.05)，這可能是因為先超聲波處理時，超聲波的空化作用破環細胞組織，產生局部破碎，加快分子擴散，有利于DON的溶出，為后續臭氧水處理時，臭氧分子和·OH自由基更易接觸到DON[28, 31]。當采用T7(先超聲波和臭水同時處理5 min，后臭氧水處理5 min)DON降解效果最好，DON含量由2.075 mg/kg降至1.070 mg/kg，降解率為48.43%，這可能與超聲作用加速臭氧溶解，使之產生的自由基與DON更好的接觸并將其氧化分解有關[28]。與此同時，以T5(先超聲波處理5 min后再臭氧水處理5 min)串聯方式處理小麥時，DON降解率為46.99%，降解效果與T7處理效果無顯著差異(P>0.05)，因此選擇T5處理進行下一步的單因素實驗。

2.3 不同臭氧水濃度對小麥中DON降解效果的影響

前期對不同單一和聯合處理方式對DON的降解效果進行比較分析，確定T5(先超聲波處理5 min，再臭氧水處理5 min)為最佳聯合處理方式，在此基礎上，改變臭氧水濃度(超聲波振幅為50%，處理時間共10 min)，對小麥中DON降解效果進行研究，結果如表4所示。研究表明，不同濃度臭氧水處理小麥籽粒5 min后，其DON有明顯的降解效果。隨著臭氧水濃度的增大，小麥中DON含量顯著降低(P<0.05)。當臭氧水濃度為58.32 mg/L時，DON含量降至1.228mg/kg，降解率高達到41.55%。提高臭氧水質量濃度，DON 與臭氧分子接觸機會越大，生成的·OH自由基也越多，間接氧化作用越顯著，因而降解作用越強[37]。

表4 不同臭氧水濃度對小麥中DON降解效果的影響

2.4 超聲振幅對小麥中DON降解效果的影響

在確定T5(先超聲波處理5 min后再臭氧水處理5 min)為最佳聯合處理方式的基礎上，改變超聲振幅(臭氧水濃度為58.32 mg/L，處理時間共10 min)，對小麥中DON降解效果進行研究。結果表明，超聲波振幅不同，小麥中DON有明顯不同的降解效果(表5)。隨著超聲波振幅的增大，DON含量逐漸降低，降解率逐漸升高。當超聲波振幅為70%時，DON含量降至1.145 mg/kg，降解率達到45.47%。這可能是因為超聲波振幅與空化泡崩潰產生的溫度和壓力有關，振幅增大，導致空化泡更為劇烈地崩潰，從而產生更高的溫度和壓力，同時也增大了羥基等自由基的濃度，使DON削減率提高[38]。

表5 超聲振幅對小麥中DON降解效果的影響

2.5 處理時間比對小麥中DON降解效果的影響

在確定T5(先超聲波處理5 min后再臭氧水處理5 min)為最佳聯合處理方式的基礎上，改變超聲波和臭氧水的處理時間比(超聲波振幅為50%、臭氧水濃度為58.32 mg/L)，對小麥中DON降解效果進行研究。由表6可知，隨著超聲波處理時間的延長和臭氧水處理時間的縮短，DON含量整體呈降低趨勢，降解率整體呈升高趨勢。當先超聲波處理9 min再臭氧水處理1 min時，小麥中DON含量降至1.198 mg/kg，降解率達到45.07%。這是因為隨著超聲波處理時間延長，空化泡數量逐漸增多，空化泡崩潰產生的高溫高壓和強氧化性自由基有利于DON的降解；此外，超聲波處理時間延長，會促使溶液溫度升高，導致水的蒸汽壓升高，表面張力和粘滯系數降低，從而更有利于空化泡的產生，提高DON的削減率[39]。

表6 處理時間比對小麥中DON降解效果的影響

2.6 正交實驗結果與分析

對臭氧水濃度、超聲振幅和處理時間比進行正交實驗，以確定DON降解的最佳條件(表7)。研究表明，對小麥中DON降解率影響因素次序為C>A>B，即對小麥中DON降解率影響最大的因素是處理時間比，其次是臭氧水濃度和超聲振幅。因此，通過正交實驗優化臭氧水協同超聲波降解小麥中DON工藝條件，最優工藝條件為A3B2C3，即臭氧水濃度為58.32 mg/L，超聲振幅為60%，處理時間比為9∶1，此條件下DON降解率最高，為50.84%。

表7 正交實驗結果

3 結論

超聲波和臭氧水不同聯合處理方式對赤霉病小麥中DON有不同的降解效果。本實驗分別采用單一、串聯、先單一后并聯、先并聯后單一和并聯的方式來研究臭氧水協同超聲波聯合處理方式對小麥中DON的降解效果。綜合考慮，確定了最佳處理方式為串聯T5，即先超聲波處理5 min再臭氧水處理5 min，此時赤霉病小麥中DON降解率最高，為46.99%。T5處理方式比之單一超聲波和單一臭氧水處理對赤霉病小麥中DON降解效果更佳，降解率分別提升約46.07%和28.84%。

在T5串聯處理方式下探討臭氧水濃度、超聲振幅和處理時間比對DON降解效果的影響。研究表明，臭氧水濃度、超聲振幅增大，超聲波處理時間的延長，均會導致DON降解率的顯著升高，三者對小麥中DON降解率影響因素次序為：處理時間比>臭氧水濃度>超聲振幅，DON降解最優工藝條件為：臭氧水濃度為58.32 mg/L，超聲振幅為60%，處理時間比為9∶1，DON降解率最高為50.84%。