富氫水對SD大鼠睪丸缺血再灌注損傷保護作用研究

李昌澤，華葉婧，王婧雯，周正，趙登宇，隋宏書

(1.山東第一醫科大學臨床醫學專業，山東 泰安；2.山東第一醫科大學組織學與胚胎學教研室，山東 泰安)

0 引言

睪丸的血供結構缺少吻合網且不容易代償性擴張，因此特別容易受到缺血性損傷，嚴重時可見睪丸萎縮、睪丸功能等損害[1]。I/R 最初是由缺血引起，然后血供恢復再灌注可誘導進一步的損傷。由于無氧代謝和乳酸積累細胞內 pH 值下降，細胞腫脹、破裂、壞死、凋亡和自噬等。再灌注后氧水平恢復，活性氧生成激增，中性粒細胞浸潤缺血組織，加重缺血性損傷[2]。在嚴重的缺血再灌注損傷中，ROS 的優勢是壓倒性的。以往的研究表明，過量的氧自由基和炎癥反應被認為是睪丸 I/R 的主要原因[3]。

氫(Hydrogen，H)是一種無色、無臭、無味、無毒的非金屬氣體。氫分子作為一種選擇性抗氧化物質。在很多 I/R 模型治中展現了良好的治療效果。氫的生物抗氧化作用有非常鮮明的優點[4]。氫的還原性比較弱，可以與氧化作用很強的ROS 直接發生反應，與 OH-反應生成水，多余的氫可通過呼吸排出體外，這是氫選擇性抗氧化的基礎[5]。氫的制備容易，價格低廉。因此，作為一種抗氧化物質，氧具有選擇性、無毒、無殘留、簡便價廉等諸多優點，具有很強的臨床應用價值[6]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

1月齡雄性清潔級SD大鼠(Hartley)，體重100～150g，購自濟南金豐實驗動物有限公司。動物房保持12h光照—黑暗循環，通風良好，室溫維持在23～26℃。本實驗動物飼養等程序均嚴格遵守執行國家《實驗動物管理條例》中的各項標準和倫理指南。

1.2 主要試驗試劑和儀器

富氫水(實驗室制備)、MDA檢測盒、SOD檢測、大鼠TNF- a酶聯免疫分析試劑盒(上海廣瑞生物科技有限公司)、大鼠IL-6酶聯免疫分析試劑盒(上海廣瑞生物科技有限公司)、大鼠IL-1酶聯免疫分析試劑盒(上海廣瑞生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 手術方法隨機分組后，按照40mg/kg戊巴比妥鈉進行腹腔注射麻醉。麻醉成功后，在大鼠右下腹處做1～2cm，用鑷子進入腹腔尋找睪丸及精索等結構。假手術組：將游離睪丸隨意撥動幾次后用生理鹽水濕紗布覆蓋睪丸，暴露90min縫合，觀察6h后處死取右側睪丸。生理鹽水對照組：將游離的睪丸順時針扭轉720。用手術線將睪丸固定在肉膜組織，防止睪丸扭轉復位，90min后扭轉復位并縫合，注射生理鹽水，觀察6h后處死取右側睪丸。氫分子治療組：將游離的睪丸順時針扭轉720。用手術線將睪丸固定在肉膜組織，防止睪丸扭轉復位，90min后扭轉復位并縫合，注射富氫水，觀察6h后處死取右側睪丸。

1.3.2 HE染色觀察睪丸組織形態

處死大鼠后收集右側睪丸，將睪丸放置10%中性甲醛溶液中固定24～36h。固定后用酒精梯度脫水，后二甲苯透明石蠟包埋，在睪丸上中下三個部位做5μm 的連續切片，切片采用HE染色。在光鏡下進行觀察，使用Johnson評級法評估睪丸損傷。

1.3.3 MDA和SOD

稱取各組睪丸質量后，制備的組織勻漿。根據MDA和SOD試劑盒說明書標準操作測量兩者含量。

1.3.4 IL-1、IL-6、TNF-α

嚴格按照試劑盒說明進行操作，測量得到曲線方程。

1.3.5 凋亡指數測量

嚴格按照凋亡指數測量試劑盒檢測，得到各個標本檢測值。

1.4 統計學分析

每次實驗至少重復3次，實驗數據的處理均由SPSS 17.0軟件分析，數據以(mean±SEM)表示。多樣本間的數據比較采用單因素方差分析，多重比較使用LSD方法。如果數據不符合單因素方差分析的條件，則采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 HE染色

假手術組各標本結構清晰、細胞排列正常，生精小管和生精細胞未被破壞；生理鹽水組和氫分子治療組與假手術相比，損傷十分明顯，睪丸組織結構混亂、層次不清和生精細胞破壞嚴重；氫分子治療組的組織結構較生理鹽水組相比，組織結構紊亂有一定改善，炎癥細胞數量減少。通過組織損傷評級可以得出氫分子治療組得到了一定的保護作用。

2.2 SODMDA

假手術生理鹽水組氫分子治療組

MDA檢測結果得出，生理鹽水對照組和氫分子治療組較假手術對照組相比MDA含量增高明顯；氫分子治療組MDA含量有一定下降。SOD中氫分子比生理鹽水對照組的表達水平增加，見表1。

表1

2.3 IL-1、IL-6、TNF-α

細胞因子(IL-1 IL-6 TNF- a)含量比較。

經過各組的睪丸標本勻漿檢測。其中生理鹽水對照組表達水平最高，氫分子治療組的表達水平有一定降低，但與假手術組對照相比二者表達含量都明顯增高。說明兩組睪丸標本都已經發生嚴重的缺血再灌注損傷，氫分子并不能完全阻斷炎癥反應發生，但在一定程度上具有緩解炎癥和保護組織作用，見表2。

3 討論

氫分子可以在形態學上維持睪丸組織，但不能完全組織損傷的發生；通過降低過氧化物濃度和增加抗氧化物活性，從而降低體內氧化應激損傷作用；前炎癥因子的檢測發現，氫分子降低炎癥反應的發生；氫分子的明顯抗凋亡作用也能緩解缺血再灌注損傷后組織凋亡的發生。綜上所述，氫分子在睪丸缺血再灌注損傷多種保護作用，值得我們進一步的深入探究。隨著研究不斷進行，對于氫分子在缺血再灌注損傷治療中提供新的方向和基礎理論。

表2