內蒙古地區93例非綜合征型耳聾患者的基因突變結果分析

黃艷 王曉華 王桂香 沙晶 齊穎 冀小平 冀云鵬

耳聾是一類常見的、難治性的、嚴重危害人類健康和生活質量的疾病，是我國最常見的出生缺陷之一，新生兒中的發病率達1‰[1,2]，據報道約有60～80%的耳聾與遺傳因素有關。其中，GJB2、GJB3、SLC26A4和MT-RNR1是導致遺傳性非綜合征型耳聾患者最主要的4個致病基因[3]。本文通過直接測序方法對內蒙古地區93例耳聾患者進行耳聾基因(22個基因，159個位點)檢測，了解該地區耳聾基因的突變情況。

對象與方法

1.對象

收集2017年11月—2018年5月來自內蒙古自治區婦幼保健院耳鼻喉科及遺傳科，呼和浩特市小百靈康復中心和內蒙古自治區殘疾人康復服務中心的93例耳聾患者臨床資料，有漢族78例，蒙族12例，回族3例。患者均已進行純音測聽，聲阻抗和聽覺腦干誘發電位等檢查，患者純音電測聽結果顯示為感音神經性耳聾，同時聲阻抗檢查結果與純音電測聽檢查結果相符；患者均經臨床耳軸位CT骨掃描放大及冠狀面重建檢查。以ABR V波反應閾值>30dBnHL為2～4kHZ范圍聽力損失的指標，聽力損失程度分級標準如下：輕度聾波V反應閾值為31～50dBnHL；中度聾51～70dBnHL；重度聾71～90dBnHL；極重度聾>90dBnHL。本研究經內蒙古自治區婦幼保健院倫理委員會審查批準，所有患者及家庭成員均簽署書面知情同意書，未成年人由其監護人代為簽署。

排除標準為：除聽力下降外，經系統身體檢查發現耳、眼等部位先天性畸形者，或伴有其他臨床表現的綜合征型遺傳性耳聾者，以及智力、身體發育異常者。

2.方法

EDTA管采集93例患者及其雙親的外周靜脈血3ml，采用聯合探針錨定聚合測序法。方法具體為：根據遺傳性耳聾基因突變位點序列信息，設計特異性擴增引物，利用多重PCR技術擴增人基因組DNA中靶序列并同時引入用于樣本識別的樣本標簽序列。將多個(≤96個)樣本的PCR產物按比例混合成為一個文庫樣本，經過一系列文庫制備過程，每個文庫樣本中的DNA序列都加上了用于測序及文庫識別的接頭序列。將適量文庫樣本按等物質的量比例混合為一個測序樣本。BGISEQ-500基因測序儀對測序樣本DNA進行序列信息讀取，每一條DNA的測序結果經過文庫接頭序列及樣本標簽序列比對拆分后將被精確定位到每一個樣本中，將每個樣本的測序結果與人類基因組比對并對22個耳聾基因的159個突變位點進行數據分析，從而確定159個位點的檢測結果。測序數據用遺傳性耳聾基因分析軟件讀取，并將所測序列與NCBI中的基因標準序列進行對比分析，記錄序列對比結果。BGISEQ-500基因測序儀由深圳華大基因生物醫學工程有限公司生產。

結果

1.檢測結果

運用聯合探針錨定聚合測序法對93位耳聾患者進行GJB2、GJB3、SLC26A4、線粒體MT-RNR1等22個耳聾致病基因，共159個位點的檢測，同時對其雙親采用同樣方法進行檢測以驗證。基因診斷結果顯示：52例患者檢測發現基因突變。其中37例檢測到GJB2、SLC26A4基因純合突變或復合雜合突變；2例MT-RNR1基因突變自先證者的母親，還有1例MT-RNR1基因突變患者的母親未采血故無法驗證；另有12例GJB2、GJB3、SLC26A4基因單雜合突變患者,突變位點遺傳自先證者的父親或母親。本次研究未檢測到GJB2、SLC26A4、MT-RNR1及GJB3以外的基因突變。

2.基因突變熱點

GJB2基因的突變熱點為c.299-300delAT、c.235delC和c.176-191delGCTGC- AAGAACGTGTG,SLC26A4基因的突變熱點為c.919-2A和c.2168A>G，MT-RNR1的基因突變熱點為m.1555A>G(見表1)。

表1 93例患者的耳聾基因分型及突變位點

3.突變檢出相對頻率

GJB2、SLC26A4、MT-RNR1及GJB3基因的突變檢出率分別為26.9% 、23.7% 、3.2% 和2.2%(見表2)。

表2 93例患者的不同耳聾基因的突變率

4.突變頻率在民族中差異

GJB2基因突變與其它基因的突變在漢族和其他少數民族(包括回族和蒙族)之間無統計學意義(P>0.05)(見表3)。

表3 93例患者GJB2基因突變位點與其它基因突變位點的臨床比較

5.突變遺傳規律

表4提示，1例耳聾患者GJB2基因的突變位點為c.35G>T，遺傳方式為常染色體顯性遺傳，該位點遺傳自患者的母親，但其母親聽力正常；1例患者的母親(耳聾患者)檢出與患者相同的GJB2基因純合突變；檢出2例GJB3基因突變，位點為c.538C>T,該位點突變符合常染色體隱性遺傳規律；2例患者檢出MT-RNR1基因異質突變，均遺自耳聾的母親，1例患者存在的MT-RNR1基因同質突變，因其母親無法采血故不能得到驗證；還有4例耳聾患者未檢測出MT-RNR1基因異質突變，而其父親均攜帶該突變。

表4 非綜合征型耳聾者部分直系親屬的耳聾基因測序結果

6.SLC26A4基因突變與前庭導水管的對應關系

本次研究提示15例患者檢測到SLC26A4基因突變，包括純合突變和復合雜合突變，9例患者同時具備大前庭導水管擴大的影像學特征，但其中2例患者無大前庭導水管擴大；7例存在SLC26A4基因單雜合突變的患者中，1例患者有大前庭導水管擴大；另有3例患者大前庭導水管擴大，但沒有SLC26A4基因突變(見表5)。

表5 SLC26A4基因突變與前庭導水管的對應關系

討論

1.GJB2基因突變相對頻率最高

本次研究通過對93個患者進行耳聾致病基因檢測，發現22例患者存在GJB2基因突變(包括純合突變和復合雜合突變)，15例患者存在SLC26A4基因突變(包括純合突變和復合雜合突變)，3例患者存在線粒體MT-RNR1基因突變(包括同質突變和異質突變)；另有3例患者存在GJB2基因單雜合突變，7例患者有SLC26A4基因單雜合突變，2例患者有GJB3基因單雜合突變(均符合常染色體隱性遺傳方式)。耳聾基因陽性檢出率為55.9%。

2.GJB2、SLC26A4、MT-RNR1 和GJB3是本地區的高發耳聾基因

本次研究提供了22個基因、159個位點的檢測，患者未檢測到GJB2、SLC26A4、MT-RNR1及GJB3以外的基因突變，且檢出率排序依次為GJB2>SLC26A4>MT-RNR1>GJB3，可見這四大基因突變在內蒙古地區發生頻率較高。

3.發現1例GJB2突變遺傳自健康母親的先證者

耳聾患者中，GJB2基因突變常表現為常染色體隱性遺傳，此次研究中GJB2基因突變的患者為25例，包括純合突變、復合雜合突變及單雜合突變，聽力學表現為重度至極重度耳聾。本研究檢測到1例患者GJB2基因的突變位點為c.35G>T，遺傳方式為常染色體顯性遺傳，該位點遺傳自患者的母親，但其母親聽力正常，關于同樣攜帶，但是致病性不同，可能有三種解釋：(1)患者GJB2其他位點或其他基因存在突變；(2)外顯不全，或者母親有其他基因減弱了這個突變的傷害；(3)普遍耳聾基因病變中女性的癥狀會弱于男性。關于第一種解釋，也有可能c.35G>T在這個家系中表現為隱性遺傳，患者是復合雜合或雙基因致病，如果沒有發現其他突變，只有這個突變，那么可能就是這個突變導致的耳聾。這幾種是列出的可能性，也可能還有其他原因。此次研究中還檢出2例GJB3基因突變，位點為c.538C>T,該位點突變符合常染色體隱性遺傳規律，與同期檢出的3例GJB2基因單雜合突變患者一樣，有待進一步做GJB2或GJB3基因的全序列檢測，因為雖然耳聾基因檢測為單雜合突變，仍提示可能為遺傳性耳聾，不排除患兒有其它未知或罕見的致聾突變基因存在，需進一步明確耳聾原因。

4.多數SLC26A4基因突變先證者存在大前庭導水管擴大的影像學特征

本次研究提示15例患者檢測到SLC26A4基因突變，包括純合突變、復合雜合突變，9例患者同時具備大前庭導水管擴大的影像學特征，但其中2例患者無大前庭導水管擴大；7例存在SLC26A4基因單雜合突變的患者中，1例患者有大前庭導水管擴大，該患者需做SLC26A4基因全測序以明確是否有罕見基因突變；另有3例患者存在大前庭導水管擴大，沒有基因突變，與上述具有SLC26A4基因純合突變或復合雜合突變但沒有前庭導水管擴大的2例患者一樣，患者需動態監測顳骨CT或核磁的變化以及時了解發病情況，需注意避免劇烈運動、噪音及發熱等情況。

5.發現3例先證者及4例聽力正常的先證者父親存在MT-RNR1基因突變

本研究提示：2例患者檢出MT-RNR1基因異質突變，均遺傳自耳聾的母親；1例患者存在的MT-RNR1基因同質突變，因其母親無法采血故不能得到驗證；還有4例聽力正常者檢測出MT-RNR1基因異質突變，均為耳聾患者的父親，可以通過禁用氨基因糖甙類藥物來避免發生耳聾。同質性是指同一細胞或同一組織中所有的mtDNA分子都是一致的，異質性是指同一細胞或同一組織中有兩種或兩種以上mtDNA共存，一種為野生型，另一種為突變型。

綜上所述，遺傳因素在非綜合征型耳聾的致聾病因中所占比例較高，在呼和浩特及周邊地區耳聾基因的研究發現GJB2 235delC 和 SLC26A4 c.919-2A>G 是耳聾基因的高發位點，線粒體 DNA 檢出率極低。國內耳聾基因的突變譜與地域分布有一定關系，北方與南方表現出不同的突變位點發生頻率不同[4,5]。本次研究未發現不同的耳聾基因突變在民族之間的差異，可能與樣本量少有關，也不排除與取樣患者地域分布的差異有關，可通過擴大樣本分布的范圍和數量來觀察不同基因突變與民族之間的關系。對于雙側感音神經性聾的患兒家庭及耳聾基因陽性患兒定期進行聽力學隨訪意義重大[6-8]，為防止再生育耳聾子女，對父母雙方實施耳聾基因測序是非常必要的。耳聾基因檢測可為降低出生缺陷的三級預防提供理論和實踐依據[9,10]。