影響凍融胚胎移植結局的年齡節點及相關因素分析

馬榮花 簡生燕 祁淑英 王莉云 熊正方 沈源春

既往諸多文獻報道，30～35歲以后隨著年齡的增加婦女的生育力逐漸下降，在使用輔助生殖技術助孕治療中，年齡更是影響臨床妊娠率的重要因素之一[1]。關于高齡患者年齡的界值，國內大多數研究是以38歲為界[2]，國外有的文獻認為女性37歲是臨界年齡。不同地區，因環境因素、飲食差異或人們生活水平等因素的不同，高齡界限也因地而異。本文以青海省人民醫院就診的不孕癥患者為研究對象，界定了凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，FET)妊娠結局下降的年齡界限，并分析了年齡對FET患者妊娠結局的影響。

對象與方法

一、研究對象

1.選擇2014年2月—2017年12月就診于青海省人民醫院生殖醫學中心行FET的不孕癥患者810例，共825個周期，記錄患者年齡及妊娠結局(臨床妊娠為陽性)。患者年齡范圍21～45歲，平均(33.5±5.0)歲，妊娠404例，妊娠率37.8%。以年齡為橫坐標，不同年齡階層移植人數(左)和妊娠率為縱坐標(右)，繪制年齡-妊娠率曲線圖，描述本中心行FET患者的年齡與妊娠率的關系，并通過繪制ROC曲線確定影響妊娠率的年齡節點。

2.選擇其中2017年1月—12月的就診于青海省人民醫院生殖醫學中心行FET的不孕癥患者282例，共282個周期。根據年齡分為<36.5歲組和≥36.5歲組。<36.5歲組患者210例，年齡范圍21～36歲，平均(30.0±2.2)歲，≥36.5歲組72例，年齡范圍36～45歲，平均(37.0±3.4)歲，比較兩組患者的妊娠率、早期流產率及活產率，并進一步采用多元回歸分析尋找兩組患者FET妊娠結局的影響因素。

3.納入標準：2014年2月—2017年12月,在本中心行體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET )助孕，并保存有卵裂期凍胚的所有患者。

4.排除標準：(1)存在子宮解剖異常、宮腔息肉、子宮內膜結核、子宮內膜炎、輸卵管積水等可導致移植失敗的患者；(2)排除患有乳腺疾病、激素依賴性腫瘤、不明原因的陰道出血、血栓栓塞疾病等禁用雌激素的患者；(3)排除子宮內膜異位癥的患者。

5.卵泡輸出率(Follicular output rate，FORT)定義：為B超監測下人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)日16～22 mm卵泡數與自然月經周期第3天3～8 mm竇卵泡數比值[3]。

二、方法

1.子宮內膜準備方案：(1)自然周期。對月經規律、既往有排卵、子宮內膜無損傷的患者應用自然周期方案，于月經第8～9天開始陰道彩超監測卵泡發育和內膜生長情況，當卵泡直徑>16 mm時每天測尿黃體生成激素(luteinizing hormone，LH)值，當尿LH陽性時注射HCG 5000 u誘導排卵，排卵后第1天內膜向分泌期轉化，給予地屈孕酮片(達芙通，10毫克/片，荷蘭蘇威制藥公司生產)，每日兩次，每次10 mg，聯合微粒化黃體酮軟膠囊(安琪坦，法杏大藥廠，法國，100毫克/粒)，每次200 mg，每日兩次，排卵后第3天上午進行FET。當天上午空腹抽取肘靜脈血測定雌二醇(estradiol,E2)和孕酮值(progesterone,P)。(2)激素替代周期。對月經不規律、既往無排卵、子宮內膜偏薄(<7 mm)的患者應用激素替代方案(除外說明書中使用激素有禁忌癥的患者)，于月經第3天給予口服雌二醇片(2/10 mg,荷蘭蘇威(上海雅培)制藥有限公司)，2 mg/d，根據陰道超聲下內膜厚度調整激素用量，每3天逐漸加量，最大可增加至4～6 mg/d，若內膜仍<7 mm則聯合給予雌二醇片 [1/10 mg，荷蘭蘇威(上海雅培)制藥有限公司] 0.5/mg，每晚睡前陰道放置，最大可增加至2 mg/d，月經第14～16天陰超監測內膜厚度及形態，若內膜厚度≥8 mm，誘導內膜向分泌期轉化，給予雌二醇地屈孕酮片口服 [2/10 mg，荷蘭蘇威(上海雅培)制藥有限公司]，總劑量與內膜轉化前服用雌二醇片相同，聯合微粒化黃體酮軟膠囊陰道給藥，每次200 mg，每日兩次。若月經第21天內膜仍未達標，則放棄本周期。內膜轉化第5天上午行FET，當天上午空腹抽取肘靜脈血測定E2和P值。解凍和移植均由副主任醫師以上職稱大夫操作(移植管型號：T-1821011-S，太平洋康泰科學儀器有限公司)。

2.胚胎質量評級：本實驗納入的胚胎均為D3卵裂期胚胎，胚胎質量評級參考 Brourn Hall Clinic胚胎評分系統[4]。Ⅰ級：卵裂球大小均勻，形態規則，具有完整的透明帶，胞質均勻清晰，胞質沒有顆粒現象，碎片0～5%之間；Ⅱ級：卵裂球大小略不均勻，形態欠規則，胞質可有顆粒現象，碎片占6%～20%；Ⅲ級：卵裂球大小明顯不均勻，形態明顯不規則，胞質可有顆粒現象，碎片21%～50%；Ⅳ級：卵裂球大小嚴重不均勻，胞質可有嚴重顆粒現象，碎片大于50%。將D3天卵裂球數目≥6個的Ⅰ級和Ⅱ級胚胎定義為優質胚胎。復蘇方法按本中心胚胎培養室玻璃化冷凍復蘇的操作常規進行。

3.統計學處理：應用SPSS 17.0統計學軟件進行數據處理。計數資料用率表示，組間比較用χ2檢驗，年齡與妊娠率的相關性采用Spearman秩相關分析,并繪制ROC曲線，計算曲線下面積(AUC)。部分研究對象以妊娠結局為因變量，以年齡、FORT、優質胚胎率、子宮內膜厚度、移植日雌激素及孕激素水平為自變量進行一般性多元線性回歸分析，模型的參數估計采用最小二乘法，衡量每一個自變量對因變量的作用大小，采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、FET妊娠率隨年齡增長呈下降趨勢：隨著年齡增長，FET妊娠率逐漸降低，且36歲后下降明顯(見圖1)，年齡與妊娠率的相關系數為-0.204，有統計學意義。由ROC曲線可知，FET患者年齡與妊娠率的Cut-off值為36.5歲，若≥36.5歲，則妊娠率呈下降趨勢(AUC為0.825，靈敏度73.7%，特異度6.4%)(見圖2)。

圖1 年齡-妊娠率趨勢圖Figure 1 Age-pregnancy rate trend chart

圖2 年齡與妊娠率的關系Figure 2 The relationship between age and pregnancy rate

二、不同內膜準備方案對兩組患者妊娠率的影響：對于不同年齡組的患者，自然周期及人工周期2種子宮內膜準備方案的妊娠率比較，差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 比較不同內膜準備方案對兩組患者妊娠率的影響Table 1 Comparison of pregnancy outcomes of different endometrial preparation schemes(%)

三、年齡對FET妊娠結局的影響：<36.5歲組臨床妊娠率為51%，≥36.5歲組(33.3%)，差異有統計學意義(P<0.05)。兩組早期流產率和活產率，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 比較不同年齡組患者FET妊娠結局Table 2 Comparison of FET pregnancy outcomes between different age groups (%)

四、影響患者不同年齡組FET妊娠結局的因素分析：進一步分析2組患者妊娠結局的影響因素，一般多元線性回歸分析發現<36.5歲組患者的年齡、FORT、優質胚胎率、移植日子宮內膜厚度是影響其成功率的主要因素，且移植日子宮內膜厚度是最重要的影響因素，其余依次排序為優質胚胎率、年齡及FORT。移植日雌二醇及孕酮對妊娠結局無影響。而≥36.5歲組患者的年齡、FORT、優質胚胎率、子宮內膜厚度、移植日雌激素及孕激素水平是影響其成功率的主要因素，年齡為最重要因素，其余依次排序為優質胚胎率、移植日子宮內膜厚度、移植日雌激素水平及孕酮水平、FORT。見表3。

表3 兩組患者FET妊娠結局的影響因素Table 3 Influencing factors of FET pregnancy outcomesbetween the two groups

討 論

由于FET可以通過減少卵巢過度刺激綜合征的發生來提高累積妊娠率[5]，并且還能最大限度地減少移植胚胎的個數而成為輔助生殖技術的重要方法。眾多研究表明，年齡、優質胚胎率、移植日子宮內膜厚度、卵泡輸出率、移植日雌激素和孕激素水平可影響FET妊娠結局。

年齡對FET妊娠結局有較大影響。WANG等[6]研究表明冷凍胚胎的妊娠率隨著年齡的增高而下降，特別是>40歲的患者。本研究通過年齡-妊娠趨勢圖發現，在21～45歲間行FET的患者中，21～30歲妊娠率上升，可達60%～80%。30～36歲雖有波動，但也有較高的妊娠率，達50%～65%。而36歲以后的患者，妊娠率下降。由ROC曲線分析得出，年齡對FET患者妊娠率有預測價值，由軟件計算得出，患者妊娠率下降年齡的臨界值為36.5歲，曲線下面積為0.825，其95%的近似參考置信區間為(0.720，0.929)，敏感性73.7%，特異性80.4%。因此，本研究將36.5歲作為FET妊娠率下降的高齡界值。進一步行統計分析發現，隨著年齡增長，臨床妊娠率逐漸下降，早期流產率逐漸增高，活產率逐漸下降(見表1)。年齡<36.5歲組臨床妊娠率達51%，年齡≥36.5組臨床妊娠率僅為33.3%，差異有統計學意義。與王偉周[7]、馬曉娟[8]等研究結果大致相似，但年齡節點略有差異。王偉周等發現40～42歲婦女妊娠率降低。馬曉娟等研究發現年齡<35歲組臨床妊娠率高于年齡>35歲組。分析可能原因：(1)不同氣候的不同地理位置的地區，因新鮮促排周期受精率、卵裂率和胚胎質量等不同，導致FET妊娠率不同。(2)本研究樣本量小，僅以2017年度的數據不足以代表整體，需收集更大的數據進行研究證實。本研究回歸分析發現，<36.5歲組患者年齡與FET妊娠結局呈負相關，回歸系數為0.119。≥36.5組患者年齡與FET妊娠結局也呈負相關，回歸系數為0.868。相對而言，年齡對于≥36.5歲組患者妊娠率的影響程度高于<36.5歲組，說明年齡對于高齡和非高齡婦女均有影響，而且對高齡婦女妊娠率的影響程度更大。年齡是無法改變的影響女性生殖能力的重要因素。Gianaroli[9]發現高齡是非整倍體發生的確定因素，非整倍體的異常會造成胚胎著床失敗，并致胚停、流產等。本研究發現，兩組早期流產率和活產率差異無統計學意義(P>0.05)，考慮與兩組樣本量小，且樣本量懸殊有關系。

卵泡輸出率已廣泛應用于IVF-ET中卵巢對外源性Gn的反應性及妊娠結局。張寧等[10]研究發現，IVF/ICSI周期中，優質胚胎率、胚胎種植率以及臨床妊娠率隨著FORT值的升高而逐漸升高，相關分析顯示FORT與可移植胚胎數、優質胚胎數呈正相關。從表2可知，FORT與兩組患者妊娠率均呈正相關，<36.5歲組回歸系數為0.002，≥36.5歲組為0.015，兩者相關性相近，考慮FORT對FET患者妊娠結局的預測，仍受年齡影響，由于相關性均很低，說明FORT對不同年齡段FET妊娠結局的預測性差，該指標對ART妊娠結局的預測意義重在新鮮促排卵周期中。

胚胎質量和子宮內膜是影響FET妊娠結局的兩大重要因素。子宮內膜容受性是指內膜允許囊胚黏附、穿透并植入從而著床的狀態，是胚胎著床的必要條件[11]，是影響FET妊娠結局的重要因素。子宮內膜厚度因其經陰道超聲檢查簡單無創的特點，已成為評價子宮內膜容受性的間接指標之一，為廣大學者認可[12]。本研究發現，兩組患者優質胚胎率與子宮內膜厚度均與FET妊娠結果呈負相關，<36.5歲組回歸系數為0.245，≥36.5歲組為0.758，由此可知，對于36.5歲以上的患者，優質胚胎率和移植日子宮內膜厚度對其成功率的影響更大，與周林燕[13]等研究結果一致。故對于高齡患者，可通過提高優質胚胎的植入率，提高移植日子宮內膜的厚度，從而提高其妊娠結局。

研究發現在胚胎植入過程中適宜雌孕激素水平的協同作用可影響子宮內膜容受性，與種植窗的開閉有關[14]，故是否移植日雌激素及孕激素越高，其妊娠率越高呢？項云改等[15]研究發現，自然周期和激素替代周期妊娠組和未妊娠組移植日雌激素水平均無明顯差異，妊娠組的血清P值水平均高于未妊娠組，另觀察人工周期FET妊娠率不隨E2水平的增高而增加。本研究發現，<36.5歲組患者移植日E2及P水平均與妊娠率無相關性，≥36.5歲組患者移植日E2及P值與妊娠率呈正相關，回歸系數分別為0.327、0.283，相關程度較高。由以上結果可推測，E2與P值對FET患者妊娠率的影響與年齡存在相關性，對于高齡女性，E2及P值增加，可增加子宮內膜的厚度及其向分泌期的轉化，使子宮內膜的種植窗與胚胎發育同步，有利于胚胎著床。因此，對于高齡女性，應選擇激素替代周期，提高體內雌激素及孕激素水平，增加胚胎著床率，提高FET妊娠率。

綜上所述，影響FET妊娠結局的因素諸多，且影響程度與年齡呈相關性。對于高齡婦女，年齡是影響其妊娠結局的最重要因素，故在行FET時應根據患者年齡，選擇個體化治療方案，以獲得更好的結局。