探討精子核蛋白組型轉換異常對精子DNA碎片指數的影響

甄國志 麥福勁 林冰 葉宇 龐穎儀 梁潔珩 梁宇玲

【摘要】 目的 探討精子核蛋白組型轉換異常對精子DNA碎片指數（DFI）的影響。方法 400份精液檢查標本為研究對象， 按核蛋白組型轉換異常率分為<30%組（200例）和≥30%組（200例）。比較兩組的精子數及DFI。結果 ≥30%組的大暈環精子數（68.9±11.5）條少于<30%組的（78.6±8.9）條， 無暈環精子數（11.9±8.1）條多于<30%組的（4.3±8.5）條， DFI（23.5±9.6）%高于<30%組的（13.8±8.7）%， 差異均具有統計學意義 （P<0.05） ;兩組中暈環精子數、小暈環精子數比較， 差異均無統計學意義（P>0.05）。結論 精子核蛋白組型轉換異常對DFI有影響， 可作為評價精子功能的一項有重要意義的參考指標。

【關鍵詞】 精子核蛋白組型轉換異常;精子DNA碎片指數;不育癥

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.22.013

Discussion on the influence of abnormal sperm nucleoprotein transition on sperm DNA fragment index? ?ZHEN Guo-zhi， MAI Fu-jin， LIN Bing， et al. Shunde Women and Childrens Hospital of Guangdong Medical University， Foshan 528300， China

【Abstract】 Objective? ?To discuss the influence of abnormal sperm nucleoprotein transition on sperm DNA fragment index （DFI）. Methods? ?A total of 400 specimens of semen were taken as the research objects， and were divided into <30% group （200 cases） and ≥30% group （200 cases） according to the abnormal rate of nucleoprotein transition. The sperm count and DFI of the two groups were compared. Results? ?The number of spermatozoa with large halos （68.9±11.5） pieces of ≥30% group was less than that of <30% group （78.6±

8.9） pieces， number of spermatozoa with no halos （11.9±8.1） pieces was more than that of <30% group （4.3±8.5） pieces， and DFI （23.5±9.6）% was higher than that of <30% group （13.8±8.7）%， and the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no statistically significant difference in number of spermatozoa with medium-sized and small-sized halos between the two groups （P>0.05）. Conclusion? ?Abnormal sperm nucleoprotein transition affects DFI and can be used as an important reference index for evaluating sperm function.

【Key words】 Abnormal sperm nucleoprotein transition; Sperm DNA fragment index; Infertility

男性不育癥是臨床常見的一種生殖疾病， 根據世界衛生組織（WHO）的統計， 15% 的育齡夫婦存在不育問題， 其中， 男方因素占40%[1]， DFI是目前評估男性精子質量及功能的重要指標。精子核蛋白組型轉換， 是魚精蛋白與DNA之間的聯系導致染色質形成層疊的結構， 使精子染色體高度濃縮、穩定。精子核蛋白組型轉換異常， 可使精子DNA穩定性降低， 增大精子DNA的損傷， 在精子受精后精核不能正常聚解， 影響雌雄原核的融合。目前對精子核蛋白組型異常與精子DNA損傷及精子質量之間相關性的報道較少， 本研究通過選取2017年5月～2019年5月本中心精液檢查的400份標本進行檢測、分析。通過觀察精子核蛋白組型轉換對DFI的影響， 明確其相關性。現報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本生殖中心自2017年5月～

2019年5月的400份精液標本， 受檢者平均年齡（28±4.1）歲， 禁欲2～7 d， 手淫方法收集精液標本， 按世界衛生組織《人類精液與宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊》（第5版）行精液常規參數檢查， 采用CASA系統（北京偉力新世界科技發展有限公司， 型號：WL JY-9000）檢測精子。

1. 2 方法

1. 2. 1 精子染色質擴散實驗 實驗步驟參考 Halo-sperm 試劑盒說明書。步驟簡述如下： 新鮮精液行常規檢查后用PBS調整至精子密度10×106/ml， 取出30 μl加入溶解的低熔點瓊脂糖凝膠30 μl 中， 溫度37℃下混勻， 加20 μl 精子凝膠混合液于預處理載玻片上， 蓋上22 cm×22 cm 蓋玻片， 4℃冰箱水平放置5 min。

移去蓋玻片， 放入酸性 DNA 變性液中， 室溫孵育7 min。取出玻片浸泡于裂解液中20 min。在蒸餾水中5 min洗去殘余裂解液。 玻片依次放入70%、90%和100% 乙醇中各2 min 脫水。晾干后玻片用瑞氏染色液覆蓋于樣本表面10 min。用自來水沖洗掉染液， 風干。 200倍光鏡下觀察， 比較精子核和核周圍暈環大小， 計算精子DNA 碎片指數。

1. 2. 2 精子核蛋白組型檢測（苯胺藍染色法）

1. 2. 2. 1 實驗原理 在精子發生成熟過程中， 與精子核 DNA 結合的堿性蛋白發生組型轉換， 富含賴氨酸殘基的組蛋白逐漸被富含精氨酸和胱氨酸殘基的魚精蛋白所替代。 在酸性條件下， 苯胺藍與賴氨酸殘基結合生成藍色化合物， 從而顯示富含賴氨酸殘基蛋白質的存在。

1. 2. 2. 2 精子核蛋白組型轉換檢測 精子核蛋白組型轉換采用苯胺藍染色法（試劑盒購自深圳華康生物醫學工程有限公司）分析精子核蛋白成熟度， 操作步驟詳見試劑盒說明書。正常參考值為核蛋白組型轉換異常率<30%。

1. 3 觀察指標 比較不同精子核蛋白組型轉換異常率間的精子數及DFI。

1. 4 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

400份精液標本按核蛋白組型轉換異常率分為<30%組（200例）和≥30%組（200例）。≥30%組的大暈環精子數（68.9±11.5）條少于<30%組的（78.6±8.9）條， 無暈環精子數（11.9±8.1）條多于<30%組的（4.3±8.5）條， DFI（23.5±9.6）%高于<30%組的（13.8±8.7）%， 差異均具有統計學意義 （P<0.05）;兩組中暈環精子數、小暈環精子數比較， 差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

3 討論

在精子發生過程中， 生精細胞內DNA含量發生著規律性變化， 富含賴氨酸的組蛋白逐漸被富含精氨酸和胱氨酸的魚精蛋白所代替。魚精蛋白與DNA之間的聯系導致染色質形成層疊的結構， 使精子染色體高度濃縮、穩定。精子核蛋白組型轉換異常， 可使精子DNA穩定性降低， 增大精子DNA的損傷， 在精子受精后精核不能正常聚解。

研究發現， DFI與囊胚形成率有關[2]， 異常的核蛋白可使過量的精源性組蛋白再次被包裝入受精卵染色質中， 妨礙卵裂時染色體的行為及胚胎發育過程中基因的表達與調控， 進而影響了雌雄原核的融合， 并且導致胚胎不能正常發育。 Kumar 等[3] 研究指出， DFI>30% 導致胚胎發育受損、胚胎質量嚴重下降、患不孕癥的風險明顯增加等不良妊娠結局。這與 Leach等[4]研究結論一致。

目前精子DNA碎片的檢測被認為是一個新的評價精子質量和預測生育能力的指標[5]， 但精子核蛋白組型轉換與DFI相關性的研究較少， 本研究通過觀察精子核蛋白組型轉換對DFI的影響， 明確其相關性。目前臨床上認為精子核蛋白組型轉換異常的正常臨界值是30%， 作者的研究發現， ≥30%組的大暈環精子數（68.9±11.5）條少于<30%組的（78.6±8.9）條， 無暈環精子數（11.9±8.1）條多于<30%組的（4.3±8.5）條， DFI（23.5±9.6）%高于<30%組的（13.8±8.7）%， 差異均具有統計學意義 （P<0.05） ;兩組中暈環精子數、小暈環精子數比較， 差異均無統計學意義（P>0.05）。 通過分析發現， 精子核DNA完整性與核蛋白成熟度間存在顯著正相關， 與先前報道一致 [6]。精子核蛋白組型轉換異常可能是男性不育的一個獨立性因素 [7] ， 目前精子DNA損傷與核蛋白組型轉換的檢測方法逐漸趨于成熟和完善， 并在臨床上得到了 一定的應用， 因此， 精子核蛋白組型轉換可作為評價精子質量和功能的另一項有重要意義的參考指標。并且對胚胎形成及妊娠臨床結局是一個有效的預測指標。由于病例數較少， 本研究結論有待于更大量病例數， 采取多中心的數據及更深入的研究以驗證。

參考文獻

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[5] World health organization. WHO laboretory? mannal? for the Exanination and processing of human semen （nonserial publications）. Journal of Andrology， 2010， 30（2）：9.

[6] 陳康， 周宇林， 余波瀾， 等.精子核蛋白組型異常及DNA損傷與 精子活動力的相關性研究.中華臨床醫師雜志（電子版）， 2013， 7（2）：575-578.

[7] 劉居理， 羅明， 盧雪芳， 等. 男性不育患者精子核蛋白組型轉換與精子密度及活力分析. 檢驗醫學與臨床， 2009， 6（13）：1061-1062.

[收稿日期：2020-04-02]