二代基因測序在精神發育遲滯患兒中的應用價值

馮文科 劉自強 賴蘭娣

【摘要】 目的 分析基于二代基因測序技術的精神發育遲滯兒童相關基因的突變及位點分布， 探討基因突變與精神發育遲滯兒童的關系及其臨床應用價值。方法 選取精神發育遲滯患兒50例為研究對象， 均給予SNP-aCGH全染色體掃描， 結合臨床表型對異常拷貝數進行分析， 找到致病區域及致病候選基因。將陽性病例（拷貝數異常）與陰性病例的一般臨床表型進行統計學比較。結果 50例患兒中， SNP-aCGH陽性5例、SNP-aCGH陰性45例。SNP-aCGH陽性患兒的生長遲緩、內臟畸形、低出生體質量兒的比例分別為80.0%、40.0%、40.0%， 均高于SNP-aCGH陰性患兒的33.3%、8.9%、8.9%， 差異均具有統計學意義（P<0.05）;SNP-aCGH陽性及陰性患兒的性別、年齡、全量表智商（FIQ）評分、特殊面容、驚厥史、家族史比例比較， 差異均無統計學意義（P>0.05）。50例患兒中， 攜帶致病或可疑致病的拷貝數變異（CNVs）陽性患兒5例， 檢出率為10.0%， 其中4例（8.0%）攜帶亞端粒區CNVs， 1例（2.0%）攜帶非亞端粒異常CNVs。結論 除不同程度的智力低下外， 本組陽性病例幾乎全部伴有生長遲緩， 部分病例伴有內臟畸形、低出生體重兒。亞端粒區域與精神發育遲滯密切相關， 但非亞端粒區域的突變可能導致疾病， 需要進一步研究。

【關鍵詞】 精神發育遲緩;表型分析;二代基因測序

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.22.093

我國是一個出生缺陷較多的人口大國， 也是世界上出生缺陷發生率較高的國家之一。隨著環境污染和食品安全的加劇， 出生缺陷的發生率呈上升趨勢。其中， 腦發育遲滯占出生缺陷的2%～3%， 不僅影響患兒的生活質量， 而且給家庭和社會帶來沉重的負擔。智力低下的病因復雜。據報道智力低下的病因未知。智力低下的病因尚不清楚， 這將影響進一步的干預。熒光原位雜交（FISH）非常耗時， 一次只能檢測1個或多個已知的異常位點。多重連接探針擴增技術（MLPA）在單個反應系統中只能檢測到50～100個基因位點， 其和FISH都不能在單個實驗中檢測到整個染色體。Illumina 二代測序平臺可作為分析智力低下多基因突變的檢測手段， 突變頻率較高， 對臨床遺傳分子診斷具有一定的指導意義。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 收集2018年6月1日～2019年10月1日本院精神發育遲滯患兒50例為研究對象。納入標準：①格賽爾發展量表（Gesell）評分（0～6歲）或韋氏量表（Wechsler scale）評分（> 6歲）均<70分;②排除圍生期窒息、感染、創傷、藥物中毒等外部因素;③核型分析未見明顯異常;④基因代謝串聯質譜分析未發現異常;⑤排除脆性X綜合征、脊髓性肌萎縮、假脂肪性肌營養不良、常見基因印跡病。特點：小頭畸形、眼距寬、耳位低、耳撲動、鼻梁塌陷、鼻梁球根、短中或長中、下頜小、高弓、腭裂、突掌、指/趾短、指/趾端缺失、指/趾甲缺失或外形異常等;內臟畸形：中樞神經系統、心血管系統、氣管、支氣管、肺、排尿系統等器官有單發或多發畸形（1例以上為內臟畸形）;生長遲緩（物理缺陷或生理缺陷）：根據頭圍、身高、體重和健康的孩子在中國相同的年齡和性別， 偏差方法用于比較增長指數≤平均值標準差異被視為缺陷。

1. 2 智力評價 ①年齡≤6歲患兒采用北京格塞爾量表（Beijing-gesell scale）， 由北京婦幼保健院統一印制， 適用年齡28 d～72個月。輕度智力殘疾：55分≤發育商（DQ）≤75分;中度智力殘疾：40分≤DQ≤54分;重度智力殘疾：25分≤DQ≤39分;極重度力殘疾：DQ <25分。②Wechsler scale評價年齡>6歲兒童智力水平（中國韋氏兒童智力量表修訂手冊）。輕度智力遲鈍：55分≤FIQ≤69分;中度智力遲鈍：40分≤FIQ≤54分;重度智力遲鈍：25分≤FIQ≤39分[1]。

1. 3 檢測方法 本研究經醫院醫學倫理委員會批準， 兒童監護人簽字。采集外周血6 ml， 離心柱法提取DNA， SNP-aCGH （Agilent180K或Affymetrix Cytoscan750K）檢測全基因組。主要步驟：①DNA酶切;②DNA熒光染色純化、定量標記產品;③比較基因組雜交;④芯片掃描;⑤數據提取與分析。對陽性結果或疑似陽性結果兒童的父母進行FICH檢測， 以確定新的突變或父母染色體異常[2]。

1. 4 拷貝數異常分析 參考在線人類孟德爾遺傳疾病數據庫（OMIM， www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）， 或與人類表型數據庫（https：//decipher.sanger.ac.uk）和PubMed數據庫文獻進行比較。在分析異常拷貝數的致病性、可疑致病性和多態性時， 參考標準為：①拷貝異常數失蹤;②異常拷貝數的斷點位于已知致病基因的內部， 符合表型的基因突變;③新增異常段> 3 Mb;④新的微刪除或微復制具有致病性或可疑性;⑤無論> 1 Mb是否遺傳或來源不明， 均可認為其具有致病性;⑥如果對健康人群中異常拷貝數有≥3項的研究， 則認為是多態性改變。攜帶致病因子或疑似致病因子的拷貝異常者為陽性。無拷貝數異常或多態病變者為陰性[3]。

1. 5 觀察指標 比較SNP-aCGH陽性及陰性患兒的臨床特點， 統計50例患兒的CNVs陽性檢出情況， 并分析CNVs陽性患兒CNVs具體區域、起始部位、類型和來源。

1. 6 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗;計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 SNP-aCGH陽性及陰性患兒的臨床特點比較50例患兒中， SNP-aCGH陽性5例、SNP-aCGH陰性45例。SNP-aCGH陽性患兒的生長遲緩、內臟畸形、低出生體質量兒的比例分別為80.0%、40.0%、40.0%， 均高于SNP-aCGH陰性患兒的33.3%、8.9%、8.9%， 差異均具有統計學意義（P<0.05）;SNP-aCGH陽性及陰性患兒的性別、年齡、FIQ評分、特殊面容、驚厥史、家族史比例比較， 差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2. 2 CNVs分析 50例患兒中， 攜帶致病或可疑致病的CNVs陽性患兒5例， 檢出率為10.0%， 其中4例（8.0%）攜帶亞端粒區CNVs， 1例（2.0%）攜帶非亞端粒異常CNVs。CNVs具體區域、起始部位、類型和來源見表2。

3 討論

除了損傷、藥物、感染等環境因素外， 精神發育遲滯多由遺傳因素引起。遺傳性精神發育遲滯具有高度異質性， 根據其發病機制可分為染色體數目或結構異常[4， 5]。不同染色體不同區域的異常拷貝及相關表型具有不同特征[6-9]。本研究發現， 50例患兒中， SNP-aCGH陽性5例、SNP-aCGH陰性45例。SNP-aCGH陽性患兒的生長遲緩、內臟畸形、低出生體質量兒的比例分別為80.0%、40.0%、40.0%， 均高于SNP-aCGH陰性患兒的33.3%、8.9%、8.9%， 差異均具有統計學意義 （P<0.05）;SNP-aCGH陽性及陰性患兒的性別、年齡、FIQ評分、特殊面容、驚厥史、家族史比例比較， 差異均無統計學意義（P>0.05）。50例患兒中， 攜帶致病或可疑致病的CNVs陽性患兒5例， 檢出率為10.0%， 其中4例（8.0%）攜帶亞端粒區CNVs， 1例（2.0%）攜帶非亞端粒異常CNVs。9p、3P、2p、15q、12p、22q、16p、17p等特異性區域對CNVs的發病機制具有特異性， 并將范圍縮小至智力低下的發病基礎。

綜上所述， 采用SNP-aCGH作為精神發育遲滯大規模臨床篩選的一線工具， 效率高， 分辨率高。SNP-aCGH不僅可以有效地縮小精神發育遲滯在染色體上致病基因的范圍， 還可以為表型與基因型及發病機制的相關性研究提供良好的技術平臺， 這是傳統技術所不具備的優勢。然而， 該技術無法檢測到平衡反轉、平衡移位、點突變、鑲嵌異常， 待相關學者進行更加深入的研究。

參考文獻

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[收稿日期：2020-01-16]