龍血素B對角質形成細胞增殖和遷移的影響

張文瑞　許春姣　郭怡婷　孫煜梅

[摘要]目的：觀察龍血素B（Loureirin B，LB）對體外培養人永生化角質形成細胞（Immortalized human keratinocytes，HaCaT）增殖和遷移的影響，探究LB是否促進創面愈合再上皮化過程。方法：噻唑藍（MTT）法檢測不同濃度LB對體外培養HaCaT細胞增殖的影響，細胞劃痕實驗分析LB對HaCaT細胞遷移的影響。結果：5、10、25、50μg/ml LB呈劑量依賴性抑制HaCaT細胞增殖（P<0.05），10、25μg/ml LB呈劑量依賴性抑制劃痕愈合及HaCaT細胞遷移（P<0.01）。結論：LB具有顯著抑制HaCaT細胞增殖和遷移的作用，提示LB可能抑制創面愈合再上皮化過程。

[關鍵詞]龍血素B;角質形成細胞;細胞增殖;創面愈合;再上皮化

[中圖分類號]Q343.6? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2020）08-0031-03

The Effects of Loureirin B on Proliferation and Migration of HaCaT Cells

ZHANG Wen-rui，XU Chun-jiao，GUO Yi-ting，SUN Yu-mei

（Central of Stomatology，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410008，Hunan，China）

Abstract： Objective? To observe the effects of Loureirin B （LB） on proliferation and migration of human immortalized human keratinocytes （HaCaT） in vitro， and explore whether LB can promote the re-epithelialization process of wound healing. Methods? The effects of different concentrations of LB on proliferation of HaCaT cells were evaluated by MTT assay， and the effects on migration of HaCaT cells were analyzed by scratch wound assays. Results? 5， 10， 25， 50μg/ml LB inhibited proliferation of HaCaT cells in a dose-dependent manner （P<0.05）. 10， 25μg/ml LB suppressed scratch closure and migration of HaCaT cells in a dose-dependent manner （P<0.01）. Conclusion? LB can significantly inhibit proliferation and migration of HaCaT cells， suggesting that LB may have an inhibitory effect on the re-epithelialization process of wound healing.

Key words： Loureirin B; keratinocytes; cell proliferation; wound healing; re-epithelialization

龍血竭（Dragons blood，DB）為龍血樹屬植物樹干受損傷后，在微生物侵染和或自然氧化作用下產生的含脂木材經乙醇提取得到的樹脂，是血竭的國產替代品[1-2]。龍血竭具有活血化瘀、止血、降糖降脂、抗菌、增強免疫、促進表皮修復、抗炎、鎮痛、抗腫瘤等藥理作用，臨床上用于治療冠心病、消化性潰瘍、軟組織損傷、放射性皮炎、燒傷、壓瘡等[3]。創面愈合基本過程有三期[4]：①炎癥期;②增生期：包括再上皮化、血管再生、纖維組織增生和傷口收縮;③改建期。大量研究表明龍血竭促進創面愈合[5-7]，但研究中多使用其簡單提取物或成方制劑，涉及其內在有效成分的研究不多，具體促進創面愈合的活性成分尚未明確。龍血素B（Loureirin B，LB）是龍血竭中含量較為豐富的二氫查耳酮類化合物，具有抗氧化[8]、活血[9]、抗炎[10]、鎮痛[11]等作用，本研究通過觀察LB對體外培養的HaCaT細胞增殖及遷移的影響，探究LB是否促進創面愈合再上皮化過程。

1? 材料和方法

1.1 細胞：人永生化角質形成細胞（HaCaT），由中南大學湘雅醫院皮膚科實驗室饋贈。

1.2 藥品與試劑：龍血素B（中國食品藥品檢定研究院，批號：111558-201407）;胎牛血清（BI，以色列）;高糖DMEM培養基、青-鏈霉素、PBS（HyClone，美國）;胰酶-EDTA消化液（Gibco，美國）;MTT、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma，美國）。

1.3 儀器：超凈工作臺（上海力申科學儀器公司，中國，型號：HFsafe-1200TE）;二氧化碳培養箱（Thermo Fisher，美國，型號：371）;倒置顯微鏡（Leica，德國，型號：DMIL-LED）;全波長酶標儀（BioTek，美國，型號：Epoch）;離心機（Eppendorf，德國，型號：5702 R）;微孔板振蕩器（Thermo Fisher，美國，型號：4625-1CEM）;電子天平（METTLER TOLEDO，中國，型號：EL204）。

1.4 方法

1.4.1 HaCaT細胞培養：將凍存狀態的HaCaT細胞于37℃下快速復蘇后，接種于培養瓶中，加入含10%胎牛血清及1%青-鏈霉素的DMEM培養液，置于37℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞接近長滿單層后胰酶消化并傳代。

1.4.2 LB母液制備：將20mg LB溶解于800μl DMSO，制備成濃度為25mg/ml的母液，分裝，-80℃保存備用。

1.4.3 MTT細胞增殖抑制實驗：取對數生長期的HaCaT細胞，經消化、重懸、計數后，調整細胞密度為5×104/ml，每孔100μl細胞懸液接種于96孔板，空白調零組加不含細胞的培養液100μl，邊緣孔100μl PBS填充。置于培養箱中培養24h貼壁后取出，棄去培養液，分別加含不同濃度LB（2.5、5、10、25、50μg/ml）10%胎牛血清DMEM培養液，平行5孔，陰性對照組加入含0.2% DMSO的培養液。繼續培養48h后棄上清液，PBS洗1次，每孔加入MTT（5mg/ml）與含10%胎牛血清DMEM按1：10體積配置的培養液100μl，37℃下繼續孵育4h，1ml注射器小心吸棄孔內培養液，加入100μl DMSO，室溫振蕩10min以使結晶物充分溶解，酶標儀上在570nm波長處測定各孔光密度值（OD值）。重復實驗3次。

相對細胞活力計算公式：

1.4.4 觀察細胞形態：取對數生長期的HaCaT細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞濃度，以2.5×105個/孔接種于6孔板中。37℃孵育24h后，更換培養液為含0.1% DMSO或25μg/ml LB的10%胎牛血清DMEM培養液，置于37℃、5% CO2培養箱中繼續培養24h，倒置顯微鏡100×、200×、400×放大倍數下觀察細胞形態并拍照。

1.4.5 細胞劃痕實驗：取對數生長期HaCaT細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞濃度，以5×105個/孔接種于6孔板中，提前用記號筆在6孔板背后約每隔1cm劃1條直線，橫穿過孔，每孔劃3條線，37℃、5% CO2的培養箱中培養，待細胞長滿單層后，取出6孔板，用10μl槍頭垂直標記線筆直劃下，貼壁緩慢加入PBS洗3次，去除漂浮細胞，實驗組加入含10μg/ml、25μg/ml LB的1%胎牛血清DMEM培養液，對照組加入含0.1% DMSO的1%胎牛血清DMEM培養液，置于37℃、5% CO2培養箱中繼續培養。分別于0h、24h倒置顯微鏡下觀察細胞的愈合程度，以每條標記線的上下緣與劃痕交叉點作為觀察點，即每孔6個觀察點，拍照記錄。重復實驗3次。使用ImageJ軟件測量劃痕面積。

劃痕愈合率計算公式：

1.5 統計學分析：使用SPSS 22.0軟件進行處理，數據用（x?±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01為差異有顯著統計學意義。

2? 結果

2.1 LB對HaCaT細胞增殖活力的影響：如圖1所示，與0.2% DMSO對照組相比，LB作用HaCaT細胞48h，在濃度為5μg/ml（P<0.05），10、25、50μg/ml（P<0.01）時細胞增殖活力被顯著抑制，并呈劑量依賴性。本次預實驗中采用濃度低于2.5μg/ml梯度濃度LB處理HaCaT細胞亦未見促增殖作用。

注：與0.2% DMSO對照組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.2 LB對HaCaT細胞形態的影響：如圖2顯示，0.2% DMSO對照組細胞密度大，貼壁能力強，僅少量細胞變圓，25μg/ml LB組細胞密度相對減小，較多細胞體積縮小變圓，與周圍的細胞連接消失，貼壁性變差，折光性增強。

2.3 LB對HaCaT細胞遷移的影響：如圖3顯示，與0.1% DMSO對照組相比，10μg/ml、25μg/ml LB作用HaCaT細胞24h，劃痕愈合被顯著抑制（P<0.01），并呈劑量依賴性。

注：與0.1% DMSO對照組相比，**P<0.01

3? 討論

血竭又名“麒麟竭”，來源于棕櫚科植物麒麟竭（Daemonorops draco BI.），由該植物果實滲出的樹脂經加工制成，多產于印度尼西亞，也稱為進口血竭。血竭成分復雜，血竭素（Dracorhodin）是其主要有效成分。而國產血竭為百合科龍血樹屬劍葉龍血樹（Dracaena cochinchinensis）的含脂木材經乙醇提取得到的樹脂，包括產于廣西、云南、海南的龍血竭，其主要活性成分為龍血素A、龍血素B等。血竭、龍血竭來源不同，主要活性成分不同，龍血竭尚不能完全代替血竭[12-13]。此外Dragons blood還可來源于巴豆屬（Croton spp.）植物及紫檀屬（Pterocarpus spp.）植物[14]。

研究表明血竭、龍血竭均可促進創面愈合。而本研究發現LB具有顯著抑制HaCaT細胞增殖和遷移的作用，提示LB可能抑制創面愈合的再上皮化過程，與預期結果相反。李丹等[15]發現血竭乙酸乙酯提取物具有顯著促進HaCaT細胞增殖作用，提示血竭可能具有促進創面愈合中再上皮化的作用。血竭素高氯酸鹽可促進成纖維細胞增殖及傷口愈合[16]，而國產龍血竭不含進口血竭所含有的血竭素[17]。于浩飛等[6]發現龍血竭軟膏促進大鼠創傷愈合，且龍血素A、B含量較高的軟膏效果更明顯，猜測龍血竭多酚性成分可能與龍血竭愈創活性有關。多酚類化合物可能在傷口表面上形成保護層，其物理屏障及抗菌抗炎作用可防止感染，也可能通過與蛋白質結合而凝結并堵塞傷口，間接促進創面愈合[14，18]。龍血竭中化學成分復雜，酚類化合物是其主要生物活性成分，根據結構主要分為：①二氫查耳酮類，有龍血素A，B，C，D和劍葉龍血素A等;②查耳酮類;③黃烷類;④黃酮類和二氫黃酮類;⑤色原酮類;⑥聚合黃酮類;⑦其他酚類，如白藜蘆醇、紫檀茋。此外還有多種萜類、甾體及甾體皂苷類成分[19]。龍血竭促進創面愈合的成分及其機制仍有待進一步研究。

研究表明LB通過TGF-β通路抑制瘢痕成纖維細胞增殖和細胞外基質沉積[20-21]，LB通過Wnt/β-catenin通路抑制肝星狀細胞增殖[22]，LB抑制脂肪細胞增殖并使細胞增殖周期阻滯在G2期[23]，提示LB可能對多種細胞有抑制增殖作用。其機制可能與LB通過激活Akt/GSK3β通路來增加微管穩定性[24]，抑制有絲分裂過程有關。觀察到LB作用HaCaT細胞后出現細胞變圓、細胞連接消失等凋亡早期形態改變，LB是否促進HaCaT細胞凋亡仍需進一步研究。

LB抑制血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）活性[9]，是其活血化瘀的重要機制。而PAI-1在上皮細胞遷移和傷口愈合中發揮重要作用[25-27]，抑制PAI-1活性會抑制上皮細胞遷移和傷口愈合[28]。因此，LB可能通過抑制PAI-1活性抑制HaCaT細胞遷移并影響傷口愈合再上皮化過程，但LB是否抑制創面愈合仍需進一步體內實驗研究。

綜上所述，LB具有顯著抑制HaCaT細胞增殖和遷移的作用，提示LB可能抑制創面愈合再上皮化過程，龍血竭促進創面愈合的成分及其機制仍有待進一步研究。此外，對龍血竭有效成分的分離與研究仍需進一步深入，探明各成分及其作用機制，細化中藥成分及用途，其應用前景將更廣闊。

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[收稿日期]2019-12-30

本文引用格式：張文瑞，許春姣，郭怡婷，等.龍血素B對角質形成細胞增殖和遷移的影響[J].中國美容醫學，2020，29（8）：31-34.