大菜粉蝶幼蟲頭部化學感器的超微結構及其對坡柳皂苷的味覺感受

馬馳宇，李豐超，于 航，劉全俊，秦小萍*

(1.云南農業大學 植物保護學院，云南 昆明 650201；2.云南農業大學 水利學院，云南 昆明 650201)

感受器作為昆蟲聯系外界環境的媒介，一直以來是昆蟲學家研究的重點[1,2]，其中頭部感受器研究更為頻繁。感受器是體壁一個特化的區域，其在昆蟲棲息地定位、寄主識別、取食、覓偶、交配、產卵以及躲避天敵等方面發揮著重要作用[3,4]，是昆蟲信息探測和接收的‘雷達’裝置，具有靈敏度高、功能專一等特點[5,6]。昆蟲感受器在異種昆蟲間形態功能差異顯著，在同種昆蟲間也不盡相同[7-9]。作為取食中心和感受器最集中的頭部，目前主要以成蟲觸角為研究對象[10-13]，有關幼蟲感受器的研究較少，已報道的有小菜蛾[14,15]、甜菜夜蛾[2]、端黑螢[16]、豇豆莢螟[17]、蘋果蠹蛾[18]、黃野螟[19]、篩胸梳爪叩甲[20]、亞洲玉米螟[21]、麻楝蛀斑螟等[22]、金銀花尺蠖[4]、山茱萸蛀果蛾[23]、雙委夜蛾[24]、棉鈴蟲[25]、朱紅毛斑蛾[26]、綠翅絹野螟[27]、小地老虎[28]、灰茶尺蠖[29]。所以，開展幼蟲頭部化學感受器的研究，對于了解幼蟲的食性機理，探究昆蟲的取食行為本質及病蟲害防治具有重要的參考價意義。

大菜粉蝶Pierisbrassicae屬鱗翅目(Lepidoptera)粉蝶科(Pieridae)，是白粉蝶屬下的一種蝴蝶，又名歐洲粉蝶、甘藍粉蝶、大白蝶，其幼蟲俗稱甘藍毛蟲，寄主為油菜、白菜、蘿卜和甘藍等十字花科植物，其為害特點為小齡幼蟲群集于葉背啃食葉肉，齡期大后則分散成小群暴食葉片，甚至連葉脈和葉柄都吃光，嚴重影響油菜和蔬菜的質量和產量[30]。目前，一些研究者對粉蝶科的部分昆蟲感受器的形態結構和功能進行了研究[5,8,23,24]。基于本課題組前期對坡柳的研究[31,32]，本文進一步報道大菜粉蝶幼蟲下顎瘤狀體感受器在受坡柳皂苷刺激后所引起的電生理反應的特征，以期進一步探明大菜粉蝶幼蟲感器結構與功能之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

大菜粉蝶(PierisbrassicaeL.)幼蟲于2018年8月采自昆明市富民縣海拔2000 m以上的野生白菜型油菜上，在云南農業大學大棚內進行室內飼養。試驗以剛蛻皮的5齡幼蟲為試驗材料。

藥品及試劑：實驗室制備坡柳皂苷；氯化鉀購于天津市北辰方正試劑廠；戊二醛(2.5%)、PBS緩沖液(pH 7.2)、國產分析乙醇。儀器：解剖鏡(OLYMPUS SZ51)、物鏡(DPTOPWF20X/12)、掃描電子顯微鏡(日立S-3000N)、鍍膜儀(E-1010)。利用頂端記錄儀(Tip Recording) 測定幼蟲的味覺電生理反應。微動操作儀(MP-22Syntech，荷蘭)。

A：頭部背面觀(Bar=1 mm)(×45)；B：頭部側面觀 (Bar=1 mm)(×90)；C/D：頭部腹面觀(Bar=1 mm)(×50)：A：觸角；C：頭冠縫；CL：唇基；FS：額縫；F：額；Fsu：額唇基溝；Lar：上唇；Lai：下唇；LP：下唇須；Mn：上顎；MP：下顎須；Mx：下顎；O(1～6)：單復眼；Spi：吐絲器；ST：剛毛。
圖1 大菜粉蝶幼蟲頭部的掃描電鏡照片

1.2 樣品制備

將選取的幼蟲置于墊有濾紙的培養皿中，于-4 ℃冷凍5～10 min，致其凍僵昏迷，在解剖鏡下，迅速從第一胸節和第二胸節之間切下頭部，用濾紙吸凈幼蟲頭部的淋巴液，以防止污染。

制備程序：取樣→固定→清洗→梯度脫水→干燥→噴金。將昆蟲頭部浸入4 ℃預冷的2.5%的戊二醛中包埋24 h以上；取出后用pH 7.2的磷酸緩沖液反復洗滌3次，每次10 min，第一次超聲3 min，后用1%餓酸固定1～2 h；取出后用pH 7.2的磷酸緩沖液洗滌3次，每次10 min，然后經30%、50%、70%、80%、90%、95%乙醇梯度脫水各一次，每次15～20 min，無水乙醇脫水2次；在室溫下自然風干后，用叔丁醛包埋2次，每次0.5 h，接下來在-20 ℃下干燥2 h，將干燥好的樣品頭部腹面朝上粘于有導電膠的樣品臺上。置于E-1010(HITACHI Co.，Ltd)真空鍍膜儀進行離子濺射噴金。用日立S-3000N(HITACHI Co.，Ltd)掃描電鏡觀察。

1.3 數據處理

電鏡照片用Adobe Photoshop CS5 軟件標注感受器的名稱，用ImageJ 1.48 軟件測量各類感受器的長度與寬度；試驗數據采用Excel進行統計。電位信號數據用Autospike 3.7(Syntech，荷蘭)進行分析，記錄電位的種類和脈沖頻率。

2 結果與分析

2.1 頭部特征

掃描結果顯示，大菜粉蝶幼蟲頭部近似橢圓形，頭長約2.75 mm，寬約2.22 mm，口器為下口式，頭背面蛻裂線呈倒“Y”字形，由頭冠縫和額縫組成；額呈三角狀，左右對稱，兩側分布著大量的毛形感受器(如圖1A)；側單眼分布在頭部兩側，側單眼與上顎之間著生著一對長三節的觸角；觸角所在的頭部腹面分布著上唇、上顎、內唇、下顎以及下唇等，上唇分布于頭部中央，唇后方分布著唇基，額唇基溝十分清晰(圖1C)，上唇對稱分布著6對長短不一的毛狀感器，2對在上顎，位于缺刻的上方。

A：觸角分為3節及第二節上的毛形感器(St)和刺形感器(Sc)(Bar=200 μm)(×180)；B：觸角梗節上的感受器：錐形感受器(Sb)、毛形感器(ST)、刺形感器(Sc)(Bar=200 μm)(×350)；C：觸角鞭節上的感受器：錐形感受器(Sb)和栓錐感受器(Ss)(Bar=50 μm)(×700)。
圖2 大菜粉蝶幼蟲觸角掃描電鏡照片

2.1.1 觸角 大菜粉蝶幼蟲的觸角分3節，由柄節、梗節、鞭節組成，約為593.73 μm長、171.97 μm寬(圖2A)。掃描電鏡觀察到大菜粉蝶觸角上有4類感受器，分別為毛形感器(sensilla trichodea，St)、刺形感器(sensilla chaetica，Sc)、錐形感器(sensillabasiconica，Sb)以及栓錐感器(sensilla styloconicum，Ss)。有一根較長毛形感器，長約454.70 μm，一根較短的刺形感器，約159.33 μm長，著生在第二節梗節上(圖2B)，另外還著生有兩個較大的錐形感受器和1個較小的錐形感受器，長度分別約為23.30、14.19、6.79 μm(圖2B)。第三節鞭節上的感受器包括一個栓錐感受器，長約24.94 μm，3個錐形感受器,長度約為19.55、8.38、6.55 μm，其中一個稍大，其余兩個較小(圖2C)。2.1.2 口器化學感受器 口器化學感受器是由下唇、下顎和舌組成的一個結合體(圖3A)。下顎位于外側，舌和下唇位于內側，下顎由下顎須和下顎瘤狀體組成。

2.1.2.1 下顎須 大菜粉蝶幼蟲在靠近口腔的部位著生有下顎須(圖3A)，下顎須由3節組成，長約196.56 μm，寬約115.36 μm(圖3B)，在第三節端部著生有8個錐形感受器(圖2C)，長分別為6.68、6.61、6.03、5.38、5.02、4.86、4.30、4.10 μm，排列為3-1-3-1的模式(圖3C)；另外，下顎須基部靠近內側分別著生有一根長約183.65 μm的刺形感受器(Sc)，一根長約259.59 μm的毛形感受器(St)。

A：口器附肢：下顎須、下顎須瘤狀體(bar=300 μm)(×150)；B：下顎須三節(100 μm)(×400)；C：下顎須端部8個錐形感受器(bar=20 μm)(×2000)；D：下顎須瘤狀體中栓錐感受器(Mss)、側栓錐感受器(Less)以及側邊兩個錐形感受器(Sb)(bar=50 μm)(×900)；E：中栓錐感受器(Mss)、側栓錐感受器(Less)端部形態(bar=30 μm)(×1500)；F：下顎須瘤狀體基部毛狀感受器(Sc)(bar=100 μm)(×400)。
圖3 大菜粉蝶幼蟲口器附肢掃描電鏡照片

2.1.2.2 側栓錐、中栓錐 下顎須瘤狀體如圖3A所示，其上主要著生有栓錐感受器(Ss)，錐形感受器(Sb)和刺形感受器(Sc)3種類型的感受器，其中，靠近舌的兩個較大的栓錐感器對幼蟲的食物選擇及取食調節起著重要作用，是昆蟲學家研究的重點，內側的是中栓錐感受器(medial styloconic sensilla, Mss)，外側的是側栓錐感受器(lateral styloconic sensilla, Less)，如圖3D所示，長寬分別為58.31、32.75 μm和42.28、36.90 μm；另外在中栓錐感器(Mss)和側栓錐感器(Less)旁還有兩個錐形感受器(Sb)，長度約為16.16、6.70 μm，一個較小的栓錐感受器(Ss)，長17.02 μm，以及外側3根等距離排列的刺狀感受器(Sc)(圖3F)。在側栓錐和中栓錐感受器頂端可見分叉的兩個凸起，一個光滑，一個粗糙，粗糙凸起表面存在微孔(圖3E)，推測可能是栓錐感受器(Ss)進行信息交流的通道。

2.1.2.3 下唇 下唇在下顎下側，由一對下唇須(Lower lip whiskers)及一個吐絲器(Spinner)組成(Bar=100 μm)，長度分別約為162.70 μm和108.76 μm，如圖4所示。下唇須上著生有一個錐形感受器和一個栓錐感受器，長約120.69、57.22 μm。下唇須的主要功能是協助下顎感觸和托擋食物，也具有一定的味覺功能，幫助寄主選擇食物。下唇中央的小管狀構造為吐絲器，吐絲器的主要功能是通過吐絲固定身體，以便蛻皮和化蛹，在吐絲器兩側有多對刺形感受器。

圖4 大菜粉蝶幼蟲口器下唇須(Bar=100 μm)(×450)

2.2 拒食物質對下顎栓錐感受器的作用

坡柳皂苷均能誘發下顎瘤狀體感受器中栓錐感受器和側栓錐感受器產生電生理信號，且單位時間內側栓錐感受器的電位數低于中栓錐感受器；同時KCl溶液刺激下顎瘤狀體栓錐感受器亦能引起脈沖頻率，中栓錐感受器高于側栓錐感受器和對照，側栓錐感受器與對照之間差異不明顯(圖5)。

A：大菜粉蝶幼蟲側栓錐感受器對1 mg/mL坡柳皂苷的電生理反應；B：大菜粉蝶幼蟲中栓錐感受器對1 mg/mL坡柳皂苷的電生理反應；C：大菜粉蝶幼蟲側栓錐感受器對2 mmol/L KCl溶液的電生理反應；D：大菜粉蝶幼蟲中栓錐感受器對2 mmol/L KCl溶液的電生理反應。
圖5 大菜粉蝶幼蟲對坡柳皂苷的電生理反應

3 討論

昆蟲化學感器影響昆蟲的行為活動，包括取食、產卵、擇偶、回避等，因此，研究昆蟲感器對于揭示昆蟲取食機制、行為及生理學具有十分重要的意義。通過掃描電鏡對大菜粉蝶幼蟲頭部感器特征進行了觀察。結果顯示：大菜粉蝶幼蟲頭部分布著4種感器，分別是毛形感器、刺形感器、栓錐感器和錐形感器。觸角上主要有 6個錐形感器、1個栓錐感器、1個毛形感器和1個刺形感器，外形上與多數鱗翅目幼蟲感器相似，與其他鱗翅目幼蟲[14,17-22,26-29,31]相比數量更多。大菜粉蝶幼蟲的單眼數量與金銀花尺蠖、豌豆莢螟、蘋果蠹蛾、小地老虎、朱紅毛斑蛾、灰茶尺蠖、草地貪夜蛾幼蟲相同[4,17,18,26-29,32]，都為6個，與5個單眼的麻楝蛀斑螟、黃野螟幼蟲不同[19,22]。8個錐形感受器以3-1-3-1序列排列在口器附肢下顎須端部,基部著生著1個毛形感器和1個刺形感器。有研究發現下顎須上的錐形感器具有嗅覺和味覺的作用[29]。下顎須瘤狀體上感器主要為栓錐感器、錐形感器、刺形感器，數量分別為3個、2個和3個，其中，較大的兩個栓錐感器中栓錐、側栓錐感器一直以來是昆蟲學家研究鱗翅目昆蟲取食機理的重點[33-38]。本研究發現，中栓錐感器和側栓錐感器頂端是一個分叉的2個凸起，一個表面光滑，一個表面粗糙，與前人的研究結果“是一個凸起”不一致[21,25]；下唇須上著生1個錐形感受器和1個栓錐感器，吐絲器較下唇須長，端部可見吐絲孔。由于環境適應性的差異，不同種昆蟲甚至同種昆蟲間存在感受器上的結構差異，這決定了昆蟲在自然界的強大的生存能力。

電生理研究表明，坡柳皂苷均能誘導中栓錐和側栓錐感器產生電生理反應，說明大菜粉蝶中栓錐和側栓錐感器中存在坡柳皂苷的抑制素細胞或者坡柳皂苷能刺激其他細胞產生反應，從而表現出對食物的厭食反應，推測可能與感受器上存在的抑制素細胞有關。前人的研究主要集中在體積較大的下顎瘤狀體上的4個栓錐感受器上，已有的研究發現，每個感覺器具有5個感覺細胞，在5個細胞中有4個味覺感覺細胞、1個機械細胞；Schoonhoven等[38]根據感覺細胞的感覺譜將能感覺寄主植物次生物質信息的感覺細胞稱為信號刺激感覺細胞，感覺初生物質的感覺細胞稱為糖和氨基酸感覺細胞或忌避細胞，如位于大菜粉蝶中栓錐感器上的信號感覺細胞主要是對十字花科蔬菜的芥子油苷類物質高度敏感，蓼二醛能對大菜粉蝶幼蟲下顎外顎葉上的中央栓錐感器內的取食抑制素感受細胞起激發作用。坡柳皂苷作為植物次生物質，其對大菜粉蝶幼蟲取食的抑制機理尚不夠清楚，有待進一步的深入研究。