高效液相色譜法測(cè)定輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品中維生素B1含量

廖雯意 肖之敏 莫益倩 雷艷

摘 要：采用高效液相色譜法檢測(cè)輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品中維生素B1的含量。樣品在稀鹽酸介質(zhì)中恒溫水解、中和后酶解，水解液用活性人造沸石凈化，凈化液用堿性鐵氰化鉀溶液衍生，正丁醇萃取后經(jīng)C18反相色譜柱分離，用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。通過優(yōu)化前處理方式調(diào)整衍生液濃度以及樣品凈化的方式，本方法標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)≥0.999，加標(biāo)回收率在95.2%～99.0%，保留時(shí)間穩(wěn)定且重復(fù)性好，RSD值為1.0%，衍生液濃度在40～60 g·mL-1，結(jié)果顯示本方法適用于檢測(cè)維生素B1含量較高的輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品，減少雜質(zhì)干擾結(jié)果準(zhǔn)確度高。

關(guān)鍵詞：輔食;營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品;維生素B1;高效液相色譜-熒光檢測(cè)器

Abstract：The content of vitamin B1 in supplementary food supplements was determined by HPLC. The sample was hydrolyzed at constant temperature in dilute hydrochloric acid medium， neutralized and then enzymolysis. The hydrolysate was purified by active artificial zeolite， and the purification solution was derived from basic potassium ferricyanide solution. After extraction with n-butanol， it was separated by C18 reversed-phase chromatographic column， detected by HPLC-fluorescence detector， and quantified by external standard method. The correlation coefficient of standard curve was ≥ 0.999， the recovery rate was 95.2%～99.0%， the RSD value was 1.0%， and the concentration of derivative solution was in the range of 40～60 g·mL-1 Less impurity interference and high accuracy.

Key words：Complementary food; Nutritional supplement; Vitamin B1; High performance liquid chromatography fluorescence detector

中圖分類號(hào)：O657.7

輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品是一種含多種微量營(yíng)養(yǎng)素（維生素和礦物質(zhì)等）的補(bǔ)充品，其中含或不含食品基質(zhì)和其他輔料，大多數(shù)添加在6～36個(gè)月齡嬰幼兒即食輔食中食用[1-2]，常用的形式有輔食營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充食品、輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充片、輔食營(yíng)養(yǎng)素撒劑。維生素B1是人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3]，易溶于水，在堿性條件下易分解變質(zhì)，在酸性條件中較為穩(wěn)定，遇光和熱效果下降。輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品中維生素B1含量較高，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB 5009.84-2016第一法高效液相色譜法對(duì)較高含量的樣品檢測(cè)不穩(wěn)定，基于此，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行優(yōu)化，從調(diào)整衍生劑的濃度和增加樣品的凈化步驟進(jìn)行前處理上機(jī)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

（1）材料。強(qiáng)化綜合營(yíng)養(yǎng)素、維生素B1（鹽酸硫胺素）≥99.0%、正丁醇（HPLC級(jí)）、鐵氰化鉀（AR）、氫氧化鈉（AR）、鹽酸（AR）、甲醇（HPLC）、氯化鉀（AR）、冰乙酸（AR）、木瓜蛋白酶（酶活力≥800 U·mg-1）、淀粉酶（酶活力≥3 700 U·g-1）、人造沸石（40～60目）。

（2）儀器。高效液相色譜儀-熒光檢測(cè)器（Agilent 1200型）、高壓蒸汽滅菌鍋（致微GI80DWS）、萬分之一電子天平（梅特勒-托利多，ML204-02型）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

（1）試液提取。準(zhǔn)確稱取樣品約0.5 g于50 mL錐形瓶中，加入30 mL 0.1 mol·L-1鹽酸溶液與樣品混勻，塞上軟塞放入高壓滅菌鍋120 ℃保持30 min，水解結(jié)束待冷卻拿出。此時(shí)樣品水解液pH為2.0～2.5，用10 g·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)至pH為4.5，加入2 mL混合酶溶液（木瓜蛋白酶1.76 g/50 mL+淀粉酶1.27 g/50 mL），搖勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中放置約16 h，將酶解液轉(zhuǎn)至50 mL比色管中，用水定容至刻度線，搖勻，離心取上清液備用，同時(shí)做空白試驗(yàn)[4-6]。

（2）樣品凈化。用少許脫脂棉鋪于層析柱底部，加水將棉中氣泡排出加入已活化好的活性人造沸石約8 g（高度不低于45 mm），液面不低于活性人造沸石。準(zhǔn)確加入20 mL上述樣品提取液，以流速1滴/s通過裝好的凈化柱，加入10 mL近沸騰的熱水沖洗凈化柱，棄去淋洗液，如此重復(fù)2次。于層析柱下放置25 mL比色管收集洗脫液，加入20 mL溫度約為90 ℃的酸性氯化鉀洗脫溶液，流速保持1滴/s，待洗脫液冷卻至室溫后用250 g·L-1酸性氯化鉀定容搖勻，即為凈化液[4]。

（3）試液衍生。準(zhǔn)確移取上述凈化液2.0 mL于10 mL試管中，加入2.0 mL堿性鐵氰化鉀溶液（分別加入20、30、40、60 g·mL-1），渦旋混勻后，準(zhǔn)確加入2.0 mL正丁醇，再次渦旋混勻約2 min后靜置10 min，

約樣品出現(xiàn)乳化現(xiàn)象應(yīng)轉(zhuǎn)至離心管離心處理，待分層后取上層正丁醇萃取層經(jīng)0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過濾至棕色進(jìn)樣品中，待上機(jī)檢測(cè)[7]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）維生素B1儲(chǔ)備液。稱取標(biāo)準(zhǔn)樣品0.012 78 g，用0.1 mol·L-1鹽酸溶液定容至25 mL容量瓶中，搖勻，此時(shí)儲(chǔ)備液濃度為506 μg·mL-1。置于0～4 ℃冰箱中保存期為3個(gè)月。

（2）維生素B1中間液。吸取2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至100 mL容量瓶，用水稀釋并定容至刻度線，搖勻，此時(shí)溶液濃度為10.12 μg·mL-1。臨用前配制。

（3）維生素B1標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。分別吸取0、50、100、200、400、800 μL和1 000 μL，用水定容至10 mL容量瓶，標(biāo)準(zhǔn)系列工作液中維生素B1的濃度分別為0、0.051、0.101、0.202、0.405、0.810 μg·mL-1和1.010 μg·mL-1。臨用前配制，與樣品同時(shí)衍生。

1.2.3 儀器條件設(shè)定

色譜柱：安捷倫ZORBAX SB-Aq 4.6×250 mm?5 μm;柱溫：30 ℃;流動(dòng)相：0.38 g/500 mL乙酸銨+甲醇（65+35）;流速：1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)375 nm、發(fā)射波長(zhǎng)435 nm;進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液衍生物注入高效液相色譜進(jìn)行維生素B1的測(cè)定，繪制校正曲線，曲線相關(guān)系數(shù)為0.999 78，如圖1所示，標(biāo)物級(jí)別和含量見表1。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

樣品通過上述方法進(jìn)行6次重復(fù)性測(cè)試，結(jié)果見表2，RSD值為1.0%（n=6）。

2.3 樣品檢測(cè)

樣品加入不同濃度衍生劑后，隨著衍生劑的濃度越高，結(jié)果越大，數(shù)據(jù)結(jié)果見表3，樣品1組和2組衍生劑濃度低滿足不了樣品衍生完全，實(shí)驗(yàn)樣品到第3、4組后衍生劑濃度可以滿足樣品衍生的終結(jié)點(diǎn)，結(jié)果數(shù)據(jù)穩(wěn)定。樣品前處理圖譜如圖2、圖3所示。

2.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

將已知濃度為10.12 μg·mL-1的維生素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液加入4組試驗(yàn)樣品中，結(jié)果見表4，每組分別加入0.5、2.0、4.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。樣品1組加標(biāo)回收率最低，為43.5%～69.6%，樣品2組回收率范圍偏低，為70.7%～80.6%，3組和4組的回收率達(dá)到90%以上，范圍在95.2%～99.0%。

3 結(jié)論

維生素B1在檢測(cè)過程中易受水分、溫度、微量元素等各種因素的影響而降解[8]，沸石具有較強(qiáng)的吸附性，樣品通過活化后的人工沸石凈化后，凈化提取液加入衍生檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示通過凈化除去雜質(zhì)干擾以及增加衍生劑濃度的方法第1組以及第2組檢測(cè)數(shù)據(jù)因衍生劑濃度較低，樣品終結(jié)點(diǎn)較高不能完全衍生;第3組和第4組衍生劑濃度40～60 g·mL-1滿足樣品衍生反應(yīng)終結(jié)點(diǎn)，回收率范圍在95.2%～99.0%，結(jié)果穩(wěn)定。此實(shí)驗(yàn)方法對(duì)含有維生素B1較高的樣品檢測(cè)除去干擾及結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確，適用于輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品中維生素B1的含量測(cè)定。

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作者簡(jiǎn)介：廖雯意（1992—），女，本科，助理工程師;研究方向?yàn)槭称芳跋嚓P(guān)產(chǎn)品的檢測(cè)。