結直腸癌的免疫微環境研究

張之亮 蘇琳

結直腸癌( colorectal cancer，CRC）是臨床上最常見的消化系統惡性腫瘤，在我國的惡性腫瘤中發病率中居 3-5位[1-2]，世界范圍內CRC 預計新增 136萬新發病例和69萬死亡病例，超過一半的CRC患者容易發生復發或遠處轉移。目前，結直腸癌的臨床檢測主要是微衛星不穩定性（microsatellite instability， MSI）、RAS基因、BRAF基因等。微衛星不穩定性是結直腸癌發生發展一個重要途徑，其可以導致腫瘤細胞內基因突變的大量產生，進而形成大量新的抗原，增加機體的免疫識別和免疫應答，產生抑制腫瘤的狀態[3-5]。FDA 已批準免疫抑制劑用于患有微衛星高不穩定型（MSI-H）或錯配修復缺陷型（dMMR）轉移性結直腸癌患者[6]。RAS基因是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的下游基因，RAS基因突變可以激活RAS/MAPK信號通路，導致結直腸癌對抗EGFR靶向藥物產生耐藥[7-9]，免疫耐受及逃避機制在癌癥進展中發揮著重要作用[10]。腫瘤免疫微環境（tumor microenvironment，TME）[11]對于抗腫瘤起著重要作用，腫瘤微環境由非腫瘤細胞（如腫瘤相關成纖維細胞）、構成腫瘤新生血管的內皮細胞和周細胞、免疫和炎性細胞、骨髓來源細胞和胞外基質組成，它們產生生長因子、化學因子和基質降解酶，促進腫瘤的增殖和遷移[12-13]。目前的結直腸癌免疫治療方法僅對部分亞型表現出良好的免疫應答率，大部分患者免疫應答率仍然較低在本文中，我們將闡述結直腸癌的免疫微環境的特征以及對于臨床的免疫治療提供指導價值。

1 一般資料與方法

1.1 結直腸癌表達譜數據檢索與整理

TCGA數據庫下載美國Illumina公司RNA-seq的level3數據，為了保證數據的準確性，我們對數據進行了預處理。最終，我們共獲得了437例結直腸癌 RNA數據及相關的臨床信息(性別、年齡、生存狀態和生存期等)。美國國立生物技術中心的GEO數據庫中下載項目集分別是GSE42284（n=188）和GSE24551（n=160）且這兩個數據集都帶有臨床數據。

1.2 分層聚類分析

采用單個樣本聚類的分析方法（ssGSEA）把表達譜數據解析出29種免疫的細胞、免疫因子和免疫通絡的豐度，我們利用ESTIMATEA軟件評估免疫細胞分值、基質細胞的分值以及免疫純度分值。利用層次聚類的方法，把結直腸癌的樣本進行免疫分型。

1.3 基因集變異功能富集和22種免疫細胞腫瘤浸潤豐度分析

基因集變異分析（GSVA），是一種非參數的無監督分析方法，主要用來評估轉錄組的基因集功能富集結果。CIBERSORT是基于線性支持向量回歸的原理對免疫細胞亞型的表達矩陣進行去卷積的一個工具，可用RNA-Seq的數據來估計免疫細胞浸潤豐度。

1.4 生存曲線分析

針對我們篩選出來的結直腸中免疫微環境中的高中低免疫組，采用 Kaplan-Meier 法繪制生存曲線來預測總生存率，并使用時序檢驗（log-rank test）來檢驗高、低風險組生存曲線是否存在差異。

2 結果

2.1 結直腸癌免疫微環境分高中低免疫組

TCGA下載的結直腸癌的RNA-seq數據，基于ssGSEA解析出來29種免疫的細胞、免疫因子和免疫通絡的豐度，通過層次聚類可以把結直腸癌中的免疫微環境分為高中低免疫組（圖1a），并且這種方法在GSE42284數據集中進行同樣分析，結果顯示GSE42284數據集的樣本也能分為高中低免疫組（圖1b）。

2.2 結直腸癌免疫微環境分高中低免疫組通路和22種免疫細胞的差異

基于GSVA分析，篩選出每個樣本的基因富集的豐度的通路矩陣，高免疫組vs.低免疫組進行差異通路分析，基于這些差異通路進行有監督聚類分析（圖2a），通過熱圖可以看到intestinal immune network for IGA production、natural killer cell mediated cytotoxicity ，toll like receptor signal pathway 、hematopolietic cell lineage等通路在高免疫組的活性高于低免疫組。基于CIBERSORT[14]軟件評估的22種免疫細胞的豐度在高中低組免疫的差異（圖2b）。T cells CD8、T cells follicular helper、Macrophages M1和 Dendritic cells resting等免疫細胞的豐度在高免疫組高于低免疫組。然而Macrophages M0 、Macrophages M2 、T cells CD4 memory resting 等在高免疫組低于免疫組。

2.3 結直腸癌免疫微環境分高中低免疫組CD274和CTLA4的表達以及生存曲線分析

圖1 基于ssGSEA解析的結果，在TCGA數據庫和GSE42284數據集中，結直腸癌分為高中低免疫組，其中低免疫組（最左側）和高免疫組（最右側）用框標出，中間沒有框標出的是低免疫組。

CD274和CTLA4在TCGA數據庫中隨著免疫活性的增高，表達水平顯著性是增加（圖3a，b）。結合隨訪數據，分別在TCGA和數據集GSE2455中分別進行高中低免疫組生存曲線分析（圖3c，d），通過圖中分析結果，可以看出在總生存期和DFS中高免疫組高于低免疫組。

3 討論

癌癥的發展是由于腫瘤細胞不斷地在逃避抗腫瘤免疫，而作為腫瘤細胞免疫監視和免疫逃逸的發生部位[15]，腫瘤免疫微環境與CRC的發生、發展及預后等密切相關[16-17]。然而對于結直腸癌免疫微環境的特征分析研究很少。

本研究利用公共數據庫數據表達譜數據，對結直腸癌的免疫微環境進行了高中低免疫組的亞型分析，且能夠在獨立數據集中驗證。研究顯示Macrophages M0 和Macrophages M2 在高免疫組低于免疫組，然而Macrophages M1在高免疫組低于免疫組。腫瘤組織中的巨噬細胞是腫瘤微環境中最多的免疫細胞，可以分泌多種細胞因子，在腫瘤發生的初期，能夠識別并清除腫瘤細胞，但隨著腫瘤的發生發展，又對腫瘤的生長、侵襲、轉移起著“雙刃劍”的作用。其中Macrophages M0 和Macrophages M2促進腫瘤的生長。T cells CD8和T cells follicular helper等免疫細胞的豐度在高免疫組高于低免疫組。浸潤腫瘤的T淋巴細胞，特別是CD8+T 細胞及與T細胞受體結合后產生IFN-γ、腫瘤壞死因子靶向腫瘤細胞，導致腫瘤細胞清除[18]。 濾泡輔助T細胞是一種新的CD4＋輔助性T細胞亞群，能持續分泌趨化因子受體而發生免疫作用。從而又激活對intestinal immune network for IGA production、natural killer cell mediated cytotoxicity ，toll like receptor signal pathway 、hematopolietic cell lineagede等免疫通路起到激活作用。盡管本研究未繼續深入探討免疫微環境影響結直腸癌不同免疫組的具體分子機制 ，但是我們的研究利用不同角度證明了高免疫組患者處于免疫激活狀態。且高免疫組與低免疫組比CD274的表達顯著性的增加。FDA已批準PD-L1免疫抑制劑應用于晚期實體瘤種[19-21]，如黑色素瘤、肺癌。因此，根據我們的方法篩選出來的高免疫組患者，可嘗試PD-L1免疫抑制劑治療的探索研究。

圖2 富集的通路（2a）和22種免疫細胞（2b）在結直腸癌高中低免疫組差異

圖3 TCGA數據庫中CD274和CTLA4在高中低免疫組的表達（3a，b）以及 TCGA數據庫和數據集GSE24551中的結直腸癌高中低免疫組的生存曲線分析（3c，d）

綜上所述，免疫微環境逐漸成為腫瘤治療的熱點，現有的結直腸癌免疫治療方法僅對部分亞型表現出良好的免疫應答率，大部分患者免疫應答率仍然較低，仍需多中心、大樣本量研究，以滿足其在多數結直腸癌患者中的有效性與安全性，從而使更多患者獲益。結直腸癌免疫治療是一個有前景性的治療選擇，值得進一步研究探索。