制備肝郁脾虛濕盛證潰瘍性結腸炎大鼠模型初探

李藝垚，馬少丹，苑述剛

（福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因復雜的直腸和結腸慢性非特異性炎癥性疾病，屬中醫“泄瀉”“痢疾”“腹痛”等范疇，發病率逐年上升。 因其發病機制尚未明確，該病近年來一直是研究熱點，最安全有效的方法就是通過建立動物模型進行相關研究。 目前制備UC 模型的方法主要有：化學刺激法、免疫刺激法、復合法等，常見的UC 中醫證型模型有：① 肝郁脾虛型［1-2］；② 脾虛（濕蘊）型［3］；③ 大腸濕熱型［4］；④ 脾腎陽虛型［5］。

中醫學根據其證型采用相應的主方加減治療UC 能取得較好療效［6-7］，本實驗為研究久瀉寧顆粒的治療機制的前期實驗。 久瀉寧顆粒是原福建中醫學院院長俞長榮教授治療慢性泄瀉的經驗方，臨床治療肝郁脾虛濕盛證之UC 療效確切。 而現有的UC 大鼠模型與本課題實驗所需大鼠模型均不相符合，故本實驗擬采用DSS 溶液灌胃結合飲食、環境、情緒等因素干預，與單純采用DSS 溶液灌胃的造模方法進行比較，試建立一種穩定的肝郁脾虛濕盛證之UC 大鼠模型。

1 材 料

1.1 動物與分組 SPF 級SD 大鼠18 只，雌雄各半，體質量（170±20） g，由浙江省實驗動物中心提供（許可證號：SCXK（浙）2014-0001）。 實驗動物在福建中醫藥大學動物實驗中心飼養和管理（環境設施合格證書：SYXZ（閩）2014-0005）。 隨機分為正常對照組、葡聚糖硫酸鈉組（DSS 組）、模型組，每組 6 只。

1.2 試劑 DSS（大連美侖生物技術有限公司，批號：S0808A）；豬油（天津聚龍糧油有限公司，批號：20180912C）；0.9%氯化鈉注射液（江西科倫藥業有限公司，批號：B18120702）。

1.3 儀器 生物組織自動脫水機（亞光醫用電子技術有限公司，型號：ZT-14S1）；生物組織石蠟包埋機（湖北錦源醫用電子技術有限公司，型號：YJ-BMC）；石蠟切片機（德國 Leica 公司，型號：RM2235）；攤烤片機（孝感市亞光醫用電子技術有限公司，型號：YT-7FB）；研究級生物顯微鏡（德國Leica 公司，型號：DM4000B）。

2 方 法

2.1 造模方法 參照相關文獻［8-10］并加以改進：大鼠適應性喂養1 周， 正常對照組予正常飼養，每日予生理鹽水灌胃2 次，每次2 mL，連續7 d。 DSS組每日灌胃 10% DSS 溶液 20 mL/kg，2 次 /d，連續7 d。 模型組采用DSS 組造模方法外，單日禁食，并予4 ℃冰水灌胃，每日1 次，每次2 mL；雙日正常飲食，并予灌胃豬油1 次，每次2 mL；每日用紗布包裹長尾夾夾住大鼠尾部，使其暴怒，每次30 min；強迫大鼠站立在2 cm 深的水中每日至少8 h。 連續7 d。

2.2 觀察指標

2.2.1 一般情況 造模期間觀察3 組大鼠一般情況，包括體質量、精神狀態、動作行為、毛發光澤度、糞便性狀等，并按 UC 活動指數（DAI）評分標準［11］進行評分，見表1。

表1 DAI 評分標準

2.2.2 病理學改變 造模第8 天，各組大鼠禁食不禁飲 24 h，腹腔注射 20%烏拉坦（5 mL/kg）麻醉。打開腹腔，從肛門向上截取大鼠結腸組織，沿大鼠腸系膜緣縱向剪開，用生理鹽水沖洗干凈，平鋪于濾紙上，肉眼觀察結腸組織形態學改變，根據結腸黏膜損傷指數（CMDI）評分標準［12］進行評分，見表2。 選取約1 cm×1 cm 病變最明顯處結腸組織，置于4%多聚甲醛固定后編號，酒精梯度脫水，二甲苯透化，常規石蠟包埋，切片厚度4 μm，蘇木精-伊紅染色（HE 染色），中性樹膠封片后，光鏡下觀察結腸病理變化。

表2 CMDI 評分標準

2.3 模型評定

2.3.1 肝郁脾虛濕盛證模型評定標準 根據文獻［13-16］，主癥：① 倦怠疲乏，懶動扎堆；② 精神萎靡，毛色光澤度下降、晦暗枯槁、稀疏易脫落；③ 便軟或溏，肛周污穢，排便時肛門紅腫，甚至脫肛；④ 行動緩慢，甚至斜行。 兼癥：① 體質量不增或增長緩慢，甚至降低；② 飲食量減少；③ 胃腸明顯脹氣。 出現 3 項主癥，或 2 項主癥加 2 項兼癥，即可認定肝郁脾虛濕盛證模型復制成功。

2.3.2 UC 模型評定標準 根據文獻［17-18］：①DAI 評分初步了解動物病癥發展的嚴重程度；②肉眼觀察結腸組織可見結腸充血水腫、腸壁增厚，嚴重者尚可見散落的潰瘍點； ③ 病理學觀察一般表現為大量淋巴、單核及中性白細胞等炎癥細胞浸潤，腺體呈現杯狀細胞減少或消失，有隱窩膿腫和潰瘍形成。

2.4 統計學處理 運用SPSS 23.0 統計學軟件進行結果分析，計量資料屬正態分布的以表示，采用單因素方差分析。

3 結 果

3.1 3 組大鼠一般情況比較 正常對照組大鼠精神狀態良好，反應靈活，飲食量正常，皮毛光澤順滑，糞便呈橢圓狀。 模型組造模第3 天出現飲食量減少，蜷縮扎堆，大便溏，肛門稍有污穢；第7 天出現精神萎靡，蜷臥懶動，嗜睡，抓取時暴躁易怒，體質量明顯下降，大便偏稀帶血，肛周污穢，與正常對照組比較，體質量顯著下降（P＜0.01），DAI 評分顯著升高（P＜0.01）。 DSS 組造模第 7 天出現懶動，蜷縮扎堆，飲食量減少，便稀，肛門污穢，與正常對照組比較，體質量下降，但不明顯（P＞0.05），DAI 評分顯著升高（P＜0.01）。 見表3、表4。

表3 3 組大鼠造模后體質量比較g

表3 3 組大鼠造模后體質量比較g

注：與正常對照組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與 DSS 組比較，3） P＜0.01。

組別正常對照組DSS 組模 型 組n666 1 d 162.00±5.69 164.17±4.88 163.67±4.64 3 d 171.00±12.96 169.50±12.04 168.50±5.35 5 d 195.17±10.52 191.83±10.05 165.83±5.171）7 d 221.27±14.45 214.53±12.72 153.84±5.802）3）

表4 3 組大鼠造模后 DAI 評分 分

表4 3 組大鼠造模后 DAI 評分 分

注：與正常對照組比較，1） P＜0.01；與 DSS 組比較，2） P＜0.01。

組別正常對照組DSS 組模 型 組n666 1 d 000 3 d 0 0.15±0.07 0.62±0.101）2）5 d 0 0.47±0.061）1.38±0.151）2）7 d 0 0.55±0.101）1.72±0.081）2）

3.2 3 組大鼠結腸黏膜改變及病理觀察比較 正常對照組結腸紋理清晰結構完整，無損傷，腺體排列整齊，間質未見水腫、充血、潰瘍。 模型組結腸黏膜明顯充血、水腫，肉眼可見潰瘍點，與正常對照組比較，CMDI 評分顯著升高（P＜0.01），黏膜層潰爛嚴重，腺體結構完全破壞，杯狀細胞消失，大量炎癥細胞浸潤，間質水腫、充血明顯且有炎癥細胞浸潤。DSS 組結腸黏膜表面可見充血、水腫，偶可見針尖樣潰瘍，與正常對照組比較，CMDI 評分顯著升高（P＜0.01），腺體排列紊亂，結構破壞，杯狀細胞消失，間質充血、水腫，大量炎癥細胞浸潤。 見表5、圖1。

4 討 論

圖1 光學顯微鏡下3 組大鼠結腸組織HE 染色圖（×20）

表5 3 組大鼠造模后 CMDI 評分 分

表5 3 組大鼠造模后 CMDI 評分 分

注：與正常對照組比較，1） P＜0.01；與 DSS 組比較，2） P＜0.01。

組別正常對照組DSS 組模 型 組n666 CMDI 評分0 1.07±0.191）1.68±0.201）2）

中醫學認為UC 的發病與脾胃功能虛弱密切相關，因飲食不節或進食生冷，損傷脾氣，或者情志失調，肝氣乘脾，脾胃運化失職，食積濕勝而致泄瀉。本病以脾虛失健為主要發病基礎，緩解期主要以脾虛為本。 本病病機與“濕”密不可分，若濕與熱結于大腸，大腸傳化失司而致泄瀉，急則暴下如注，緩則時止時瀉。DSS 法是制備UC 的常用方法之一，其致炎機制可能與細胞功能失調、腸道菌群失調有關［19］，通常采用自由飲用一定濃度的DSS 溶液制備急性UC 模型。 制備中醫證型的UC 模型常在此基礎上施加環境、飲食、情緒等因素干擾，使模型出現與中醫證候相類似的癥狀。

本實驗擬建立肝郁脾虛濕盛型UC 模型，控制DSS 誘導次數，使模型產生急性期與緩解期交替出現的癥狀，更符合人類UC 發病周期規律，且有研究［20］發現 DSS 溶液定量灌胃誘導的 UC 模型在潰瘍出現的時間、程度、位置比自由飲用相比均一性高。本實驗結果表明：單純采用DSS 定量灌胃，模型雖在有結腸組織病理學改變，但在飲食量、皮毛光澤度等一般情況未見明顯變化，缺乏中醫證候特點；采用DSS 定量灌胃結合內外因素干預的方法，模型既表現出倦怠懶動，飲食量減少，拱背，毛色光澤度降低等體征，結腸黏膜改變也符合組織病理學特點，故本研究選擇DSS 溶液定量灌胃結合內外因素干預的方法誘導UC 模型。

DAI 評分表是較公認地、能較準確地早期診斷UC［21］，本實驗中模型組與正常對照組比較，DAI、CMDI 評分均顯著升高，在造模后也出現類似肝郁脾虛濕盛的癥狀，結腸組織病理學也支持造模成功結論，以上實驗結果初步顯示：肝郁脾虛濕盛證之UC 大鼠模型基本成功。 本實驗后期將對此造模法再做深入研究，試采用DSS 溶液定量灌胃重復誘導的方法，探究該模型的穩定性，以建立較理想、穩定、更符合實驗課題的肝郁脾虛濕盛證UC 大鼠模型。