厚樸三物栓質量標準研究

馮連晶，胡建萍，黃慶德*

（1. 福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2. 泉州醫學高等專科學校，福建 泉州 362100）

厚樸三物湯出自《金匱要略》卷上，由厚樸、大黃、枳實3 味中藥組成。 厚樸行氣除滿，去積消脹，為君藥；大黃瀉熱通便，攻積導滯，為臣藥，助厚樸泄腸胃之熱，行氣化瘀；枳實為佐藥，主降氣，協同厚樸破滯氣，消積除脹。 三味藥合用，具有行氣除滿、去積通便的功效，主治實熱內積、氣滯不行、腹部脹滿疼痛、大便不通。 厚樸三物栓是應用現代制劑工藝將厚樸三物湯制備成栓劑，用于預防腹部術后腸系膜粘連。 為控制厚樸三物栓的質量，本實驗采用薄層色譜法（TLC）對大黃進行定性鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定柚皮苷、和厚樸酚、厚樸酚的含量，為全面有效地控制厚樸三物栓的質量提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20A 高效液相色譜儀、SPD-M20A PDA 檢測器（日本島津公司）；HH-6 數顯恒溫水浴鍋（常州市國華電器有限公司）；KQ-500E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA2004N 萬分之一電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；YOKOZX 紫外線分析暗箱（武漢藥科新技術開發有限公司）；XS 205 十萬分之一電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］。

1.2 藥物與試劑 柚皮苷對照品（批號：110722-201111）、和厚樸酚對照品（批號：110730-201112）、厚樸酚對照品（批號：110729-200412）、大黃酸對照品（批號：110757-200206）、大黃素對照品（批號：110756-200110）、大黃酚對照品（批號：110796-201017）、大黃對照藥材（掌葉大黃，批號：121249-201003）均購自中國食品藥品檢定研究院；厚樸三物栓［自制，批號：160501（樣品 1）、160502（樣品 2）、160503（樣品 3）］；陰性樣品栓（自制，批號：160504）、甲醇、乙腈（國藥集團化學試劑有限公司）；磷酸（天津市福晨化學試劑廠）；以CMC-Na 作為黏合劑的硅膠G 薄層板；甲醇、乙腈均為色譜純；乙醇、磷酸均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 TLC 定性鑒別

2.1.1 大黃對照溶液的制備 稱取大黃細粉5 g，加甲醇50 mL 超聲提取30 min，濾過；濾液揮干，殘渣8%鹽酸溶液10 mL，超聲10 min；再加氯仿30 mL，超聲處理30 min；再渦旋，取上清液揮干，用甲醇溶解，即得大黃藥材對照溶液。

2.1.2 大黃酸、大黃素、大黃酚混合對照溶液的制備 精密稱定大黃酸、大黃素、大黃酚對照品各2 mg，于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度線，即得大黃酸、大黃素、大黃酚混合對照品溶液。

2.1.3 厚樸三物栓樣品液的制備 取厚樸三物栓1 粒，按照“2.1.1”項下“加甲醇 50 mL 超聲提取……”進行操作，即得厚樸三物栓供試品溶液。

2.1.4 陰性對照液的制備 按照處方量制備缺大黃藥材的陰性樣品栓。取陰性樣品栓1 粒，按照“2.1.1”項下“加甲醇50 mL 超聲提取……”進行操作，即得陰性對照溶液。

2.1.5 TLC 定性鑒別 用移液槍分別吸取5 μL 的上述4 種溶液，分別點于同一以CMC-Na 作為黏合劑的硅膠 G 薄層板上，放入展開劑［1］為石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（17∶5∶1）的溶液中展開后取出，晾干，置于365 nm 的紫外光燈下進行檢視，再將其放于氨蒸氣飽和的展開缸中熏蒸后，置于日光下檢視，斑點變為紅色。 見圖1。

圖1 厚樸三物栓TLC 圖譜

2.2 HPLC 定量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil?Platisil ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）。 梯度洗脫條件：0～10 min，A∶B（25∶75）；10～30 min，A∶B（25→85∶75→15）；30～40 min，A∶B（85∶15）。 檢測波長：294 nm；柱溫：35℃；流速：0.8 mL/min；進樣量：10 μL。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷對照品、和厚樸酚對照品、厚樸酚對照品各14.45、17.63、16.74 mg 置 10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得含柚皮苷、和厚樸酚、厚樸酚分別為1.445、1.763、1.674 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取厚樸三物栓10 粒，切細研碎，稱取2.6 g，置具塞錐形瓶中；加甲醇30 mL溶解，超聲30 min，濾過，置50 mL 量瓶中；用甲醇稀釋至刻度，用 0.45 μm 濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按照處方量制備缺厚樸、枳實的栓劑，按“2.2.3”項下方法制備陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性試驗 將對照品溶液、供試品溶液及陰性對照液分別注入高效液相色譜儀進行檢測，按照“2.2.1”項下的色譜條件進樣，記錄結果，色譜圖見圖2。 結果顯示：陰性對照無干擾，表明專屬性良好。

圖2 厚樸三物栓 HPLC 色譜圖

2.2.6 線性關系考察 分別精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液 0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.50 mL于10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取10 μL 進樣，測定峰面積，以質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，求得柚皮苷、和厚樸酚、厚樸酚回歸方程，相關系數，線性范圍。 結果見表1。

2.2.7 精密度試驗 精密吸取對照品溶液1 mL 置10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，照“2.2.1”項下條件重復進樣6 次，測定峰面積，計算柚皮苷、和厚樸酚、厚樸酚的RSD 分別為0.32%、0.28%、0.46%，表明儀器精密度良好。

表1 3 種成分的線性方程、相關系數和線性范圍

2.2.8 重復性試驗 取同一批樣品6 份，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測定柚皮苷、和厚樸酚、厚樸酚的峰面積，計算柚皮苷、和厚樸酚、厚樸酚的平均含量，其 RSD 分別為0.52%、0.45%、0.64%，表明本方法重復性良好。

2.2.9 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h 測定柚皮苷、和厚樸酚、厚樸酚的峰面積，其 RSD 分別為 2.53%、2.04%、2.68%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.2.10 加樣回收試驗 取同一批已知含量的厚樸三物栓，切細研碎，精密稱取52 mg，共6 份，分別加入一定量柚皮苷對照品、和厚樸酚對照品、厚樸酚對照品，照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，測定峰面積，計算柚皮苷、和厚樸酚、厚樸酚的平均回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率測定結果

2.2.11 樣品含量測定 分別取厚樸三物栓3 批樣品，按照上述供試品溶液的制備方法和色譜條件進樣測定，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（n＝3）

三批樣品的測定結果表明：厚樸三物栓中柚皮苷、和厚樸酚、厚樸酚的含量穩定。考慮中藥飲片質量差異及工藝誤差，故設定栓劑的含量限度為不得低于所測含量的80%，因此，每粒厚樸三物栓含厚樸以厚樸酚（C18H18O2）、和厚樸酚（C18H18O2）計，分別不得少于 15.08、5.46 mg，含枳實以柚皮苷（C27H32O14）計，不得少于7.65 mg。

3 討 論

3.1 TLC 定性鑒別 根據2015 版《中國人民共和國藥典》［1］大黃項下TLC 鑒別的展開劑條件進行預實驗的基礎上，對展開劑比例作稍作調整，為石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯－甲酸（17∶5∶1），結果顯示：采用上述展開條件對厚樸三物栓中的大黃進行定性鑒別，方法專屬性強，斑點清晰，分離度好。

3.2 HPLC 定量測定 在色譜條件選擇時，根據指標成分的性質，參考相關文獻［2-5］，通過前期預實驗考察不同流動相比例對分離度、峰形的影響，最終確定采用乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫條件：0～10 min，A∶B（25∶75）；10～30 min，A∶B（25→85∶75→15）；30～40 min，A∶B（85∶15）。其結果表明：在該條件下，各成分分離效果好，色譜峰對稱性較好。