小分子物質與適配體的相互作用規律

彭媛媛 肖星凝 朱龍佼 陶曉奇 許文濤

（1. 西南大學食品科學學院，重慶 400715；2. 中國農業大學食品科學與營養工程學院 北京食品營養與人類健康高精尖創新中心農業部農業轉基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083）

隨著市場經濟的迅猛發展，人們生活水平的日益提高，全民健康意識也逐步提高。為了保障人民衣食住行各方面的安全，進一步發展檢測分析技術顯得尤為重要?，F代社會的快節奏在一定程度上促使檢測技術的革新，建立精準快速的方法檢測對人類健康和生態系統造成有害影響的污染物，已成為了各領域關注的熱點［1］。適配體（Aptamer）是一類由幾十個核苷酸組成單鏈短序列，與傳統的抗體相比適配體對靶標物質除了具有更高的敏感性和選擇性外，還存在能大規模生產、批次間變異小、貨架期長等諸多優點。適配體經修飾可進一步增強其穩定性和靶向性，可作為抗體替代品用于檢測分析領域［2］。

適配體主要有單鏈脫氧核糖核酸（ssDNA）和核糖核酸（RNA）兩類［3］。適配體可通過鏈內堿基間的氫鍵相互作用折疊形成諸如莖環、凸環、口袋和假結等二級結構，而富G序列還可通過鳥嘌呤間的氫鍵相互作用，片層堆疊形成G-四鏈體和G-三鏈體結構［4］，這些二級結構可集合形成獨特的三級結構對目標分子進行特異性識別。與抗原抗體結合的方式類似，適配體可結合金屬離子、化合物、蛋白質、病毒、生物細胞和細菌等多種靶標物質［5］。

小分子靶標物質的分子量不超過500 Da，包括獸藥、農藥、生物標志物、環境污染物、內源性代謝物及生物毒素等。與大分子物質不同，分子量小的目標物與寡核苷酸適配體的尺寸差異較大，使得小分子靶標的適配體篩選分離的難度更大［6］。小分子靶標物質的痕量檢測在食品安全、醫學診斷、環境監測等領域均具有重要的意義，尤其是檢測重金屬、毒素和抗生素等可能對人體造成有害影響的小分子具有實際應用價值。目前，小分子靶標適配體的篩選總體成功率并不高［5］，故有必要根據小分子與適配體的相互作用規律，針對目標物設計合理有效的檢測進程，建立快速準確檢測分析小分子靶標的方法。因此，本文從靶標分子的結構性質出發，梳理了近年來各類小分子靶標與適配體的作用規律及作用方式，旨在為完善小分子分析檢測體系提供有益參考。

1 小分子物質的分類及性質

1.1 單質

單質的性質往往與其元素的性質相關，由金屬鍵結合而成的固態金屬晶體內部存在游離電子，而原子則采取密堆積形式以保證晶體的穩定。有研究表明金屬較易失去電子而帶正電荷，如鎘［7］、鋅［8］等。而非金屬單質則往往帶負電，如砷（As）與帶負電的DNA之間存在一定程度的靜電排斥作用，砷的適配體（Ars-3）對As（III）的識別過程存在爭議［9］。

1.2 化合物

化合物可分為無機和有機兩大類。無機化合物大致可分為氧化物、鹽、酸、堿等，往往通過電離得到的離子與其他物質相互作用，如氧化鋅通過Zn2+與DNA相互作用形成復合結構［10］。根據有機化合物的碳骨架結構差異可分為鏈狀化合物和環狀化合物。有機化合物結構中含有-OH、-CONH2的部分往往具有親水性，通常含有-NH2的結構常帶正電，含基團-COOH的部分則帶負電。這些結構基團共同影響著鏈狀化合物的性質，如鏈狀結構的L-瓜氨酸和L-精氨酸，其性質由帶正電的氨基和帶負電的羧基共同決定［11］；而鏈狀化合物乙醇胺的功能特性，也受其結構中羥基和氨基的影響［12］。

環狀化合物可分為碳環化合物和雜環化合物，其性質往往受到帶電基團及其所含環狀結構的影響。根據結構中是否含有芳香環，碳環化合物可分為芳香族和脂環族，雜環化合物可包括芳雜環和脂雜環。與碳環化合物不同，雜環化合物往往包含由碳原子和其他原子（如氧、氮、硫等）形成環狀結構。雜環化合物是迄今為止數目最龐大的一類有機化合物，這些雜環結構廣泛存在于各種具有生物活性的天然產物、有機材料、農藥和藥品中［13］。常見的脂雜環小分子化合物有：麥芽糖、鳥嘌呤、茶堿和鏈霉素等。芳雜環類有多巴胺、可卡因、氯霉素和四環素等［11］。

2 小分子與適配體的作用規律

適配體能在識別靶標的同時鑒別這些小分子間極其微小的結構差異，這種高特異性識別過程與適配體和靶標的相互作用形式有關，包括帶電基團和芳香環結構等。例如，L-酪氨酸的RNA適配體（dopa2）能分辨靶標帶電荷基團的差異，而對芳香環結構的識別沒有特異性，故dopa2對L-多巴胺（其芳香環結構與L-酪氨酸相近）有高親和力，但對缺少羧基的多巴胺的親和降低力約10倍［14］。當靶標分子既沒有平面芳香環、也沒有帶電荷的功能基團時，可能會產生一種與常見內部凸環和發卡環結構不同的結構，如與生物素結合的適配體具有獨特的假結折疊結構（圖1），這種新型識別方式可能是由靶標的自然屬性所致［15］。

圖1 生物素適配體的假結折疊結構［15］

小分子往往通過疏水和靜電相互作用、氫鍵和堿基堆積等作用力結合適配體［16］。金屬類小分子靶標往往會“鑲嵌”在適配體鏈上，而小分子化合物則會被“條網狀”的適配體鏈段兜住。小分子與適配體的鍵合方式主要是非共價結合，包括靜電結合、溝面結合、插入作用和嵌入作用［17］。如圖2所示，靜電作用是指小分子物質中帶正電的部分通過靜電相互作用與核酸分子骨架中帶負電的基團鍵合的過程。溝面結合是指分子與DNA雙螺旋結構中小溝或大溝的堿基對邊緣發生相互作用的過程，構型體積較小的化合物主要沿著小溝方向與核酸結合，氫鍵以及堿基的疏水性均能推動兩者的鍵合。插入結合是指小分子的共軛芳香環平面插入核酸雙鏈（RNA局部雙鏈或DNA雙螺旋）堿基對的過程，相鄰堿基間的范德華力、疏水作用和π-π電子堆積均能穩定結合構象。嵌入結合是指小分子借助氫鍵和范德華力替代DNA小溝處的錯配堿基并與相應的堿基產生π-π堆積作用的過程。總之，與靜電結合與溝面結合相比，插入結合和嵌入結合的鍵合方式相對較強；嵌入結合與插入結合的形式相近，但嵌入結合的相互作用更強。

圖2 小分子與DNA雙螺旋結構的鍵合方式［18］

靶標分子往往存在多個與之特異性結合的適配體，而適配體序列長短及堿基組成均決定了其間的結構差異。經SELEX技術篩選得到的適配體往往含有部分冗長序列，可結合定點突變技術，在保留適配體與靶標結合區域完整的同時截斷多余冗長序列。有研究表明，適配體識別靶標的區域具有較為復雜的結構，如發夾、三通連接和G-四鏈體結構等［19］。對于某些由嘌呤和嘧啶堿基交替排列呈莖環狀發夾結構的適配體而言，莖部序列在某種程度上能對環狀結構的穩定起到一定的作用，有研究成功通過延長莖部序列長度穩定核酸構象［20］。三通連接結構的適配體則是通過堿基互補配對并折疊形成合適的二級結構，在三通連接處形成“空腔”利用疏水作用與靶標（如可卡因、膽酸等）結合，而非借助極性功能基團識別靶標［21］。G-四鏈體結構由4條富含鳥嘌呤的鏈段形成的支架和幾個在靶標識別過程中起作用的環狀基序組成，該結構與靶標間存在較強的疏水結合能力，故OTA、核仁素、氯化血紅素和熒光素等靶標物質的適配體往往呈G-四鏈體結構［22-23］。

3 小分子與適配體相互作用的分析方法

研究靶標小分子與核酸相互作用的方法主要包括兩大類，一類是較為直觀地分析微觀結構變化，如透射電子顯微鏡、選區電子衍射、X-射線晶體衍射、掃描隧道顯微鏡、原子力顯微鏡等［24-25］；另一類方法在相互作用的研究過程中更為普遍，主要是借助圖譜、物質性質變化來間接分析體系的相互作用。寡核苷酸適配體作為核酸的一部分，亦可借鑒這些方法分析其與小分子的相互作用。

3.1 借助圖譜的分析

常見的用于分析相互作用的圖譜有紫外-可見光吸收光譜、熒光發射光譜、拉曼散射光譜、圓二色譜和核磁共振波譜。借助吸收光譜和發射光譜可以推斷小分子靶標與核酸適配體間的相互作用模式以及結合強度。兩者的相互作用會促使靶標紫外-可見光吸收光譜的波長和強度發生變化，且作用力往往與吸收光譜的紅移程度和減色率呈正比［26］，若靶標分子與核酸以相對較弱的靜電結合方式鍵合，吸收光譜的特征峰則無明顯變化。而一些有熒光特性的染料小分子通過溝面或插入結合適配體，在熒光發射光譜中會出現熒光增強的現象［27］。借助拉曼散射光譜則能得到分子結構轉變（包括振動和轉動）的相關信息，據此有研究發現高濃度的Cd2+會促使DNA雙螺旋結構中的部分堿基堆疊坍塌、氫鍵斷裂［28］。借助圓二色譜并結合透析實驗可推斷小分子物質與核酸的鍵合方式，通過對比復合結構對偏振光的吸收程度可判斷小分子對DNA螺旋軸的取向及其立體選擇性。借助核磁共振波譜可分析小分子物質與核酸的結合區域，由于不同位置的氫原子在共振狀態中所吸收的電磁波頻率不同，故小分子的氫化學位移與核酸堿基中的質子化學位移值重疊處即是兩者的親和位點［26］。

3.2 借助性質的改變

當晶體結構等參數缺乏、紫外吸收光譜和熒光光譜的變化均不明顯時，可借助凝膠電泳、流體力學、解旋溫度差異以及分子的電活性等，分析推斷小分子化合物與核酸的相互作用模式與結合強度。瓊脂糖凝膠電泳的條帶位置反映了核酸片段的大小差異，借此能初步判斷小分子與其是否存在一定的相互作用：若兩者間僅是靜電結合，那么電泳遷移率的變化不大；而插入結合的模式則會使得復合結構的電泳遷移率減慢。流體力學中復合體系黏度的變化反映了核酸片段長度的差異：若小分子以插入結合的方式與核酸作用，整個片段長度增加體系黏度增大［29］；若是不完全插入結合小分子的部分嵌入會使原有DNA雙螺旋結構更加扭結，復合體系黏度減?。欢遣迦虢Y合（如靜電結合、溝面結合）的模式則對體系的黏度的影響不大［30］。還可借助DNA雙鏈的解旋溫度判斷小分子與DNA的相互作用模式：小分子的插入結合模式會在一定程度上抑制DNA雙鏈的解旋，從而導致解旋溫度升高；分子的嵌入結合模式會引起堿基翻轉錯位，致使原有核酸結構的穩定性降低，解旋溫度降低。伏安特性的變化也能反映核酸的構象，且電勢差與半波電位的差異則能體現小分子物質與核酸的結合方式［31］。

4 小分子靶標與適配體相互作用的類型

理論上，任一小分子靶標物質均能從RNA和DNA文庫中篩選分離得到適配體。RNA具有的模塊化性質使其能夠形成獨立的結構域，并自動折疊呈“口袋”，同時保持對小分子靶標的結合特性。由于DNA缺少RNA所具有的2'-羥基，篩選出的RNA和DNA適配體往往具有明顯不同的序列和折疊結構［11］。但也存在與靶標分子結合的DNA和RNA適配體具有相同序列（堿基T在RNA序列中替換為U）的報道：這兩條適配體均形成G-四鏈體結構，并以較低的親和力與核黃素結合［32］。

4.1 金屬類小分子靶標

4.1.1 與核酸嘧啶基團作用 帶正電的金屬小分子往往與其適配體的嘧啶基團中帶負電的部分結合。不同金屬的適配體往往具有不同的結構，如Cd（Ⅱ）、Zn2+和 Pd2+的適配體呈莖環狀結構，靶標分子通過配位鍵結合適配體環狀部分，而莖狀部分堿基對則利用氫鍵起到一定的穩定作用［7，33］。金屬氧化物ZnO與適配體Poly-d（T）30的鍵合過程是：Zn2+利用氫鍵和靜電相互作用規則性的結合于DNA分子胸腺嘧啶堿基間，依次堆積逐漸形成晶體狀ZnO納米殼層［25］。

4.1.2 與核酸嘌呤基團作用 在靶標與其適配體的結合過程常會受到體系中金屬離子的影響，如Mg2+的存在可增強赭曲霉毒素A與其適配體間的相互作用，由于赭曲霉毒素A的適配體富含鳥嘌呤，K+也可通過與鳥嘌呤O6的靜電作用，進一步誘導其G-四鏈體結構的形成并起到一定的穩定作用［34］。而Ag+則能螯合鳥嘌呤堿基中的N7和C6O基團，破壞原有的G-四鏈體結構［35］。

4.2 化合物類小分子靶標

4.2.1 由靶標的帶電基團主導 帶電基團在一定程度上會影響適配體與靶標間的相互作用，氨基酸類小分子主要借助氨基和羧基與適配體結合，羥基起到一定的輔助作用［11］。RNA適配體通常圍繞氨基酸折疊，通過氫鍵識別靶標分子［36］，如谷氨酸尿素部分帶負電荷的氧原子與尿嘧啶的N3之間通過氫鍵作用；而精氨酸帶正電的氨基，則作為氫鍵的供體與胞嘧啶作用［37］。

糖類小分子與適配體的相互作用主要依賴于氫鍵和疏水作用，其中氫鍵由糖苷類化合物（如麥芽糖、阿拉伯糖等）吡喃環中的氧與羥基形成，由于帶電基團和芳香環結構的缺乏，以羥基結構為主的糖類小分子與其適配體的親和力并不太強［11］。Masud等［38］研究表明在適配體胸腺嘧啶核苷C5處修飾質子化的氨基陽離子，可增強其與唾液酸化乳糖（含有帶負電的羧基）的親和力，并以此推測該適配體為三通連接結構，其莖部區域含有經修飾的胸腺嘧啶核苷。不同的適配體的特異性結合區域存在差異，Yang等［39］測試了DNA適配體對寡糖基序的選擇性識別能力，發現其能夠辨別大分子表面糖蛋白修飾的微小差異；而Srisawat等［40］篩選出葡聚糖G-100的RNA適配體，推測其最小識別位點是由4個以上葡萄糖殘基通過α-1，6-糖苷鍵相連而成。

還有部分天然產物也同樣借助氫鍵與疏水作用結合適配體。Zimmermann等［41］利用核磁共振波譜推斷了茶堿-RNA適配體的復合結構，結果表明適配體利用復雜的氫鍵網絡和堆疊相互作用“包裹”茶堿，兩者的特異性識別取決于多個接觸位點，咖啡因N7位置比茶堿多一個甲基，該甲基所致的空間排斥在一定程度上會削弱氫鍵作用，這也是茶堿適配體對咖啡因親和性極低的原因。Stojanovic等［42］篩選了可卡因的DNA適配體并對其二級結構進行推測，結果表明在其三通連接處具有親脂性。Kato等［43］則發現膽酸的單鏈DNA適配體也表現為三通連接結構，其形成的“空腔”可經疏水作用結合靶標。有研究表明甾族化合物（又稱類固醇，如膽酸）的適配體不是通過極性功能基團特異性識別靶標，而是通過折疊成合適的二級結構來識別大小形狀不同的靶標分子［21］。

4.2.2 由靶標的環狀結構主導 適配體主要通過腺苷和核糖結構識別核酸類小分子，其特異性受空間作用的影響［11］。例如，最初篩得ATP的DNA適配體主要識別靶標的堿基和糖，5'-磷酸基團不參與結合；隨著篩選思路地轉換，也得到了強烈作用于ATP的β-和γ-磷酸基團的新型RNA適配體［44］。部分輔助因子類小分子與適配體的結合也與環狀結構有關，如S-腺苷蛋氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、輔酶A的腺苷部分與其RNA適配體結合［11］，黃素嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide，FAD）則是通過其結構中的異咯嗪母核與其適配體作用［45］。

染料類小分子噻唑橙可與G-四鏈體結構的DNA適配體形成復合物并產生強烈熒光，而溴化乙錠的三環平面基團亦可插入結合于DNA互補配對結構的堆積堿基中產生熒光。RNA適配體往往以“結合口袋”的形式識別染料小分子，識別過程主要受到堿基堆積和形態互補的推動。孔雀石綠的適配體借助A30堿基卡住MG的外苯環以形成穩定的復合結構，其結合位點呈不對稱內部凸環，兩側經互補配對形成雙鏈RNA結構［46-47］。熒光染料DFHBI結合于RNA適配體的G4-鏈體結構中，未成對的鳥嘌呤殘基將DFHBI卡住，使其兩個芳香環在同一個平面形成熒光構象［48］。

4.2.3 多種相互作用共同決定 如圖3所示，還有一些小分子化合物與適配體的相互作用由帶電基團和環狀結構共同介導，包括四環素、鏈霉素、氯霉素及紫霉素等抗生素類靶標。由4個環組成的四環素平面結構，一側具有的親水功能基團能形成離子相互作用；另一側則作為疏水面存在非極性和堆積作用。Berens等［49］通過鉛剪切和硫酸二甲酯（Dimethylsulfate，DMS）修飾實驗分析了RNA適配體與四環素結合后的二級結構變化，并構建四環素最小適配體cb28的最簡二級結構圖，推斷出cb28結構中L3的G39可能是兩者結合位點，而四環素的6位羥基是兩者相互識別的關鍵。氨基糖苷類抗生素的基本構件是2-脫氧鏈霉胺，其多樣性取決于糖環上的羥基、甲基和羥甲基，其適配體呈莖環狀結構，莖部常存在小的內環或單個核苷酸的凸起，主要帶負電荷的環狀結構則作為結合“口袋”結合帶正電荷的氨基糖苷類化合物［11］。氯霉素由芳香族氨基酸（苯丙氨酸等）的生物合成途徑中衍生而來的，其RNA適配體由3個螺旋組成，中間被兩個不對稱的凸環（一側是單個的腺苷酸，另一側含4-6個腺嘌呤）隔斷［50］。鏈霉素是含有胍基的氨基環醇糖苷類抗生素，Tereshko等［51］通過對鏈霉素與適配體的復合物進行X射線晶體結構的高分辨解析，發現適配體呈L型結構，L型的每個臂上的兩個環形成一個口袋將鏈霉素夾在其中，并通過堿基邊緣與其接觸。紫霉素是由6個氨基酸組成的堿性肽，其核心結構是一個十六元環，Wallis等［52］發現篩選得到的紫霉素RNA適配體大部分含有由14個核苷酸組成的高度保守區，莖環狀的適配體通過“假結”（環部序列與其鄰近序列的堿基配對形成類似“打結”形狀）識別紫霉素。

圖3 部分抗生素類靶標與其適配體的結構［11］

5 應用

所謂“磨刀不誤砍柴工”，小分子靶標與適配體相互作用的研究必不可少。這一階段的準確探索奠定了后續改性修飾適配體并將其應用于實際的基礎，同時又印證了前期適配體篩選過程的準確性和有效性。

5.1 適配體的篩選

了解小分子靶標與適配體的相互作用形式及其結合位點，能在一定程度上使得核酸文庫序列設計更有效，同時還可根據已知結合位點推測靶標結構類似物的適配體序列，而進一步比對不同基團間的相互作用，明確適配體的特異性，避免該適配體在后續應用中出現的交叉反應。金屬類小分子在適配體篩選過程中往往能起到一定的輔助作用，有研究采用NaCl濃度梯度富集精氨酸適配體，而篩選L-異亮氨酸適配體的過程也需要Zn2+參與，這可能是因為異亮氨酸會與Zn2+結合或者適配體含有“Zn2+的RNA結構”［11］。緩沖液體系中的金屬離子種類不同，篩得適配體也不同，在篩選維生素B12的適配體時選用含有Li+和Mg2+的緩沖液，所得的適配體依賴于高濃度的Li+，但結合時不需要Mg2+存在，當用Na+替代Li+用于篩選時，所得的適配體不再依賴Li+，而是強烈依賴Mg2+［11］。

5.2 生物傳感器的搭建

了解小分子靶標與適配體的相互作用形式及作用位點，有利于搭建精準高效的生物傳感器，實現對物質進行定性定量檢測，而借助生物傳感器的信號變化亦能推測核酸自身的堿基錯配及靶標結合位點。有學者基于適配體結構轉換功能搭建了3類熒光生物傳感器，包括分子信標、分裂適配體傳感器、應變位移傳感器［53］。這些傳感器均涉及到明確靶標與適配體的結合位點，使得兩者在結合態和游離態之間處于最佳熱力學平衡。而確定最佳位點及作用堿基數，往往需要通過大量的序列設計和重復試驗。而復合體系中的金屬離子也會影響適配體與小分子靶標的結合，如Mg2+與四環素的酮和烯醇基團配位是其與cb28適配體結合的關鍵［49］；而在鏈霉素適配體也需在Mg2+存在下才能結合鏈霉素［51］。故通過一定的技術手段準確了解小分子與適配體之間的作用方式就顯得至關重要，同時也為上述生物傳感器的順利搭建起到了一定的積極意義。

6 總結與展望

小分子與核酸的鍵合方式主要有共價結合和非共價結合，與DNA雙螺旋結構不同，單鏈適配體與小分子的相互作用幾乎是非共價結合，且兩者間“溝面結合”較少。適配體傾向于經堿基互補配對折疊形成莖環狀結構，并纏繞靶標小分子，使其以“插入結合”和“嵌入結合”的形式嵌入適配體結構中。小分子化合物往往通過其帶電的基團與適配體形成氫鍵，且兩者間還存在疏水和靜電相互作用。當小分子結構中含有環狀結構時，除了帶電基團的影響，由于環狀結構自身的空間位阻作用，使得體系中往往存在堿基堆積效應。帶正電的金屬離子通常與適配體嘧啶基團上帶負電的結構作用，金屬離子在一定程度上能調控適配體的構象控制G-四鏈體結構的形成與坍塌，亦能調控靶標與適配體的結合能力，如Mg2+能控制四環素和鏈霉素結合其RNA適配體?？傊?，小分子物質的自身結構特性是影響適配體與其結合的關鍵，鏈狀適配體通常圍繞靶標小分子纏繞折疊，結合位點附近堿基的帶電基團使其穩定，非結合位點的序列則往往利用堿基互補配對呈“莖稈”狀穩定整個復合結構。

結構決定性質，物質的性質又影響其功能特性，準確把握小分子物質與適配體的鍵合方式與結合位點，探究小分子物質與適配體的復合結構是適配體應用與發展的基礎。但影響適配體折疊的因素有很多，包括pH值、離子強度、陽離子種類等。目前缺少非常靈敏的監測核酸適配體結構變化的手段，適配體結構的柔性使得其與靶標間較難形成晶體結構，使得X-ray晶體衍射的檢測適配體結構信息變得困難，而基礎研究數據的缺乏，往往使得從結構和功能的角度分析問題的過程變得困難［54］。近年來，研究者們主要利用小分子物質與適配體性質的改變，結合各類圖譜分析，推斷兩者間可能存在的結合方式。分類整合已有小分子物質與適配體的復合結構信息，針對可能存在的性質變化擬定標準化測定分析過程是未來的發展趨勢。隨著生物技術的飛速發展，新型檢測模式的深入研究，結合各項新技術建立新型適配體結構功能分析體系指日可待。