植物中硫化氫和一氧化氮信號的交互作用

孫玉瑩 邱雪梅 葉芯妤 李忠光

（云南師范大學生命科學學院 生物能源持續開發利用教育部工程研究中心 云南省生物質能與環境生物技術重點實驗室，昆明 650500）

近年來，關于硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S）的研究已從毒性分子轉向信號作用，并已初步證實其在種子的萌發、植物的生長、發育，以及響應逆境脅迫中起著重要的信號作用［1-4］。植物中，H2S通過合成和分解途徑控制其在細胞中的動態平衡。這些途徑中的關鍵酶包括L-/D-半胱氨酸脫巰基酶（L-/D-cysteine desulfhydrase，L/DCD）、亞硫酸還原酶（Sulfite reductase，SiR）、氰丙酸合成酶（Cyanoalanine synthetase，CAS）、O-乙酰絲氨酸硫醇裂解酶［O-acetylserine（thiol）lyase，OAS-TL］、碳酸酐酶（Carbonic anhydrase，CA）等（圖1）［1-4］。此外，為了維持動態平衡，防止過多的H2S對細胞的毒害作用，植物中多余的H2S可以氣體的形式散失到空氣中［1-4］。

目前，一氧化氮（Nitric oxide，NO）也被認為是植物中的重要第二信使，與H2S、氨氣（Ammonia，NH3）、一氧化碳（Carbone monoxide，CO）等一起被稱為氣體信使［5-8］。這些氣體信使參與種子的萌發到植物的衰老的整個生理過程。在植物中，NO的動態平衡也受多條途徑的調控，這些途徑包括氧化途徑和還原途徑。前者的關鍵酶包括NO合成酶（Nitric oxide synthase，NOS）類似蛋白（Nitric oxide synthase-like proteins，NOSL）、多胺氧化酶（Polyamine oxidase，PAO）、多 胺 氧 化 還 原 酶（Polyamine oxidoreductase，POR）、黃嘌呤氧化還原酶（Xanthine oxidoreductase，XOR）等（圖2）［5-8］。還 原 途 徑的關鍵酶主要包括硝酸還原酶（Nitrate reductase，NR）、質膜結合的亞硝酸：NO還原酶（Plasma membrane-bound nitrite：NO reductase，NiNOR）和NO形成亞硝酸還原酶（NO-forming nitrite reductase，NOFNiR）（圖2）［5-8］。

已有研究表明，信號分子H2S和NO在植物中存在交互作用，參與多種生理過程，如種子的萌發、根形態建成、氣孔運動、果實的成熟、耐逆性等［3，6-7］。但在這些生理過程中，有關H2S和NO交互作用的確切機理仍鮮見報道。本文根據H2S和NO的最新研究進展，對二者的交互作用（化學反應、作用于共同的靶分子、調節彼此代謝酶和其他信號途徑等）進行了討論，以期待及推動該領域的迅速發展。

1 H2S在植物中的穩態

由于高濃度的H2S易與亞鐵離子結合，因此對含有亞鐵離子的蛋白質（如細胞色素氧化酶、血紅蛋白、肌紅蛋白等）的結構進行修飾，繼而抑制其活性和功能，從而表現出對細胞的毒害作用［1-4］。所以，同其他信號分子［如Ca2+、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和NO］一樣，H2S在植物細胞中必須進行嚴格的控制，保持其動態平衡。通常，植物細胞中H2S的穩態受合成和清除共同調節。H2S的合成有多條途徑，主要受關鍵酶LCD、DCD、SiR、CAS、OAS-TL等 的 調 節［1-4］。LCD、DCD和SiR分別以L-/D-半胱氨酸（L-/D-cysteine，Cys）和亞硫酸為底物，催化H2S的合成［1-4］。此外，CAS以L-Cys為底物，合成H2S，此途徑在合成H2S和氰丙酸的同時，清除細胞中過多的氰化氫（HCN）（圖1）［1-4］。研究也表明，植物中或通過氣孔從空氣中吸收的硫化羰（Carbonyl sulfide，COS）又稱氧硫化碳、羰基硫，可被細胞中的碳酸酐酶（Carbonic anhydrase，CA）轉變為CO2和H2S（圖1）［9-10］，反應式如下：

植物中清除H2S的主要方式是將其迅速地轉變為半胱氨酸，此過程主要由半胱氨酸合成酶（cysteine synthetase，CS，EC 4.2.99.8）來承擔。CS又稱O-乙酰絲氨酸硫醇裂解酶（O-acetylserine（thiol）lyase，OAS-TL），此酶催化的是可逆反應，在合成Cys的同時，也可以Cys為底物合成H2S（圖1）［1-4］。此外，植物體內過多的H2S也可以氣體的形式散失到植物體外，從而維持細胞中H2S的動態平衡［1-4］。研究表明，H2S也可與含有半胱氨酸殘基（巰基）的蛋白質（Proteins，Pr）結合，對蛋白進行一種新的翻譯后修飾——硫巰基化（S-sulfhydrylation，SSH），也稱過硫化（Persulfidation，-SnH）［11-16］，從而調控其活性和功能。

圖1 植物中硫化氫（H2S）的動態平衡

2 NO在植物中的穩態

與其他信號分子一樣，過多的NO對植物細胞也有毒害作用，特別是當它與超氧陰離子自由基（Superoxide radical，·O2-）結合后，產生的過氧亞硝酸根離子（Peroxynitrite，ONOO-）破壞作用更強，可使蛋白質、脂質、核酸等生物大分子發生硝基化［5］。因此，維持植物細胞中NO的動態平衡也很重要。植物中，NO的合成包括氧化途徑和還原途徑。氧化途徑合成NO的關鍵酶主要包括NOSL、PAO、POR和XOR［5-8］。NOSL以精氨酸（Argenine，Arg）為底物，氧化形成NO。NO合成酶（Nitric oxide synthase，NOS）是動物體中合成NO的關鍵酶，此酶在植物體內尚未完全證實。PAO和POR分別以多胺（Polyamines，PA）和羥氨（Hydroxylamine，HA）為底物，合成NO。此外，硝酸鹽/亞硝酸鹽在XOR的作用下，也可合成NO（圖2）［5-8］。

圖2 植物中一氧化氮（NO）的動態平衡

3 H2S和NO的交互作用

在正常情況下，植物中H2S、NO和代謝保持動態平衡，當內外因引發H2S信號或NO信號時，這種動態平衡就會被打破，通過H2S和NO信號的交互作用（化學反應、作用于共同的靶分子、調節彼此代謝酶和其他信號途徑等），引發新的信號途徑，建立新的動態平衡（圖3）。

3.1 H2S與NO反應

作為具有較強化學活性的H2S和NO，除了修飾上述所陳述的蛋白質外，二者也可以發生反應，產生HSNO（Thionitrous acid）［22-23］。由內外因子引發的H2S和NO信號，二者可通過化學反應，削弱或消除H2S和NO信號；或將這兩種信號轉化為另一種信號HSNO，進而轉換和完成信號傳導途徑，最終調節各種生理過程。研究表明，在NO供體硝普 鈉（Sodium nitroprusside，SNP）中 加 入H2S供體（NaHS），可降低NO的釋放量或阻斷NO的釋放，暗示H2S可能與NO發生直接的反應。進一步研究表明，H2S在生理pH條件下以H2S/-SH的反式磁酸/堿基對的形式存在，而NO具有順式磁性質，因此，H2S和NO直接反應的可能性不大，所以推測H2S和NO的反應，相當于硫醇和NO的直接反應［22］。目前，研究顯示，在NO供體中加入H2S，可改變預期基于NO的生理功能，然而用HgCl2或CuCl2處理這些反應混合物，會產生亞硝酸鹽或NO，并恢復預期的生物學功能，暗示H2S和NO的反應，可產生S-亞硝基硫醇、HSNO、HNO等中間產物［22-23］。用SNP和NaHS的混合物處理細胞，沒有增加環鳥苷酸單磷酸（cGMP）水平，這表明NaHS通過中間產物的形成阻斷了NO的釋放。此外，向這些細胞中添加HgCl2（促進S-亞硝基硫醇分解生成硝酸鹽），可顯著提高cGMP水平，進一步支持中間產物S-亞硝基硫醇存在的說法［22-23］。

圖3 植物中硫化氫（H2S）和一氧化氮（NO）的交互作用

作為中間產物的S-亞硝基硫醇，能與H2S進一步發生反應［23-24］。GSNO與GSH混合，產生不同數量的亞硝酸鹽、N2O和NH3，且亞硝酸鹽和N2O的含量與GSH成正比，NH3的含量與GSH成反比。在有氧條件下，氧的存在可能會使NO氧化生成能夠與H2S反應的亞硝化物質，并形成作為中間產物的HSNO，HSNO進一步反應可以生成NO和HNO，可以恢復細胞中NO的含量，維持NO的動態平衡和生物學功能［23］。此外，用H2S直接取代HSNO，可生成HNO和HSSH，這也有力的支持了中間產物HNO的存在［24］。H2S與過氧亞硝酸鹽反應，可生成亞硫酰基硝酸鹽（HS（O）NO），以此可作為NO供體。同時，H2S可與GSNO通過反硝化反應生成HSNO，HSNO可進一步生成NO和HNO，并且HSNO可自由地跨過細胞膜擴散，進一步行使其信號功能［23］。

3.2 H2S和NO作用于共同的靶分子

除了發生化學反應外，H2S和NO也可作用于共同的靶分子，特別是含有巰基和金屬離子的蛋白質分子，對其巰基分別進行硫巰基化和亞硝基化，繼而對蛋白質分子，特別是酶蛋白的結構進行修飾，從而調節酶蛋白的活性，完成信號轉換和傳遞［11-21］。在模式植物擬南芥中，蛋白組學的研究表明，大約2 330個蛋白（約占整個蛋白組的5%）可被硫巰基化修飾，927個蛋白可被亞硝基化修飾，可同時被硫巰基化和亞硝基化修飾的蛋白大約639個［11］。NO對蛋白質的翻譯后修飾主要包括對含有半胱氨酸殘基的蛋白質（如過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶、NADPH氧化酶等）和金屬蛋白（如鳥苷酸環化酶、血紅蛋白、順烏頭酸酶等）的亞硝基化和酪氨酸殘基的硝基化（nitration）（如鳥苷酸環化酶、O-乙酰絲氨酸硫解酶、鐵氧化還原蛋白-NADP氧化還原酶等）［17］。更深入的研究表明，H2S和NO可對硫代謝關鍵酶谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）、糖代謝關鍵酶甘油醛3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase，GAPDH）、乙烯（Ethylene，ETH）代謝關鍵酶1-氨基環丙烷1-羧酸合成酶［1-（Aminocarbonyl）-1-cyclopropanecarboxylic acid synthetase，ACS］和1-氨基環丙烷1-羧酸氧化酶［1-（Aminocarbonyl）-1-cyclopropane- carboxylic acid oxidase，ACO］，以及活性氧（Reactive oxygen species，ROS）代謝關鍵酶過氧化氫酶（Catalase，CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbic acid peroxidase，APX）等進行翻譯后修飾，繼而調控相應的代謝過程［16-19］。

谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）是谷氨酰胺（Glutamine，Gln）合成的關鍵酶，可將谷氨酸（Glutamate，Glu）和氨（Ammonia，NH3）轉變為Gln，繼而維持植物細胞中的Glu、Gln、NH3的動態平衡［25］。H2S可對GS進行翻譯后修飾，即硫巰基化，抑制其活性，進而調節硫代謝過程［17-20］。許多研究表明，Glu和NH3是植物體內2種重要的第二信使，參與硫代謝和其他代謝過程。H2S信號的產生，可導致GS的抑制，繼而促進Glu和NH3的積累，故將H2S信號轉變為Glu信號和NH3信號2條信號通路［17-20，25］。Glu信號可通過與谷氨酸受體類似蛋白（Glutamate receptor-like，GLR）結合，激活Ca2+通道，繼而將Glu信號轉變為Ca2+信號途徑［17-20，25］。NH3信號也可引發Ca2+信號級聯下游的生物學事件［25］。

GAPDH和磷酸丙糖異構酶（Triosephosphate isomerase，TPI）是糖酵解的關鍵酶，前者催化3-磷酸甘油醛轉變為1，3-二磷酸甘油酸；后者主要催化磷酸二羥丙酮（Dihydroxyacetone phosphate，DHAP）向3-磷酸甘油醛（3-phosphoglycerate，PGA）的轉變，此反應是可逆反應［16］。H2S信號的引發，可導致GAPDH和TPI硫巰基化作用，繼而激活其活性，促進糖酵解過程，從而減少或削弱另一個第二信使甲基乙二醛（Methylglyoxal，MG）的積累（MG是糖酵解代謝的副產物，特別是當TPI和GAPDH活性受到抑制后，其積累尤為顯著），削弱MG信號途徑［17］。相反，NO可引發GAPDH亞硝基化，從而抑制其活性，阻礙糖酵解過程，引發MG信號。這些暗示H2S和NO在糖酵解過程中的交互作用，繼而調節MG信號途徑。同樣，蘋果酸脫氫酶（Malic dehydrogenase，MDH）、乙醇酸氧化酶（Glycolate oxidase，GOX）和乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）的活性受H2S和NO調控，硝基化抑制MDH和GOX活性，而硫巰基化則激活MDH、丙酮酸脫氫酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）和LDH活性，從而推動糖代謝過程［18］。

此外，ETH是重要的氣體信使，其代謝關鍵酶ACS和ACO也受H2S和NO調控。信號分子H2S和NO可競爭ACS和ACO上的巰基，使其發生硫巰基化作用或亞硝基化作用后，抑制其活性，從而抑制的ETH的合成，削弱ETH信號途徑及相關的生理過程［19］。更有意思的是，已發生亞硝基化的靶蛋白（包括ACS和ACO），在H2S信號引發時，可將亞硝基化的ACS和ACO轉變為硫巰基化的ACS和ACO，即基團-SNO轉變為-SSH，同樣可起抑制這兩個酶活性的作用（圖3）［18-19］。

同樣，抗氧化酶CAT、APX、谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（Monodehydroascorbate reductase，MDHAR）、脫氫抗壞血酸還原酶（Dehydroascorbate reductase，DHAR）、過氧化還原蛋白（Peroxiredoxin，Prxs）、谷胱甘肽硫S-轉移酶（Glutathione S-transferase，GST）、超 氧 化 物 歧 化 酶（Superoxide dismutase，SOD）、NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）等是植物細胞內維持ROS動態平衡的關鍵酶，這些酶分別承擔ROS的清除和產生，從而維持細胞中的ROS平衡［16-17］。此外，這些酶活性仍然受信號分子NO的修飾。當NO信號引發時，可導致這些酶發生亞硝基化。亞硝基化會抑制NOX和CAT活性，并激活APX、GR、DHAR、MDHAR、SOD、GST和苯丙氨酸裂解酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）［18-19］。另 外，CAT、APX和NOX活 性 也 受H2S調控，硫巰基化抑制CAT和NOX活性，而激活APX［11-16］。因此，H2S和NO通過轉錄后修飾（主要是硫巰基化和亞硝化）在維持植物細胞內ROS穩態中起著重要的作用。

此外，光合作用關鍵酶1，5-二磷酸核酮糖羧化/加 氧 酶（1，5-ribulose diphosphate carboxylation/oxygenase，Rubisco）和細胞凋亡關鍵酶半胱天冬蛋白酶（Metacaspase-9）的活性受NO的調控，亞硝基化可抑制二者的活性，從而減少植物的光合作用和細胞凋亡［19］。在小麥幼苗中，滲透脅迫可引發H2S信號，繼而提高甜菜堿醛脫氫酶（Betaine aldehyde dehydrogenase，BADH）的活性，進一步提高甜菜堿的水平；而在玉米幼苗中，NO也可提高BADH活性，從而促進幼苗中甜菜堿的積累，最終提高植物的耐逆性［26］。以上結果表明，在逆境脅迫下，NO和H2S都可激活BADH活性，合成甜菜堿，暗示BADH可能是NO和H2S共同作用的靶分子之一。

3.3 H2S和NO對彼此代謝酶的調節

3.3.1 H2S對NO代謝酶的調控 在黃瓜幼苗中，過量的硝酸鹽對黃瓜幼苗有毒害作用，這種毒害作用可被外源H2S處理所緩解，并且這種緩解作用可能與H2S觸發的MAPK/NO信號有關［27］。進一步的研究表明，在番茄幼苗中，H2S可激活NR活性，繼而提高幼苗中NO水平，最終緩解過量的硝酸鹽對幼苗的毒害作用，而H2S清除劑HT則降低NR活性，從而導致NO含量的減少［28］，暗示H2S可調控NO產生酶NR的活性。此外，H2S可促進大麥根部NO的積累，繼而通過調NO控離子平衡而緩解鹽脅迫傷害，而NO清除劑cPTIO則消除H2S對大麥耐鹽性脅迫的緩解作用［29］。最新研究表明，H2S可激活XOR活性，繼而提高內源NO水平，最終調節生理過程［30］。這些實驗暗示，H2S可通過調控NO代謝酶的活性，實現對NO信號的調控。

在氣孔運動中，NO已被證實是H2S調控氣孔運動的介導者。H2S供體NaHS和GYY4137處理，均可導致NO熒光水平小幅升高，表明這兩種H2S供體，可刺激保衛細胞中NO的產生，或減少保衛細胞中NO的清除，從而增加保衛細胞中NO的含量［31］。更 重 要 的 是，當NaHS或GYY4137與 脫落酸（Abscisic acid，ABA）同時處理時，其熒光強度明顯低于ABA的獨立作用，這表明NaHS或GYY4137可減少由ABA引起的NO的積累［31］。此外，H2S清除劑亞?；撬幔℉ypotaurine，HT）對NO的積累也有抑制作用［31］。

3.3.2 NO對H2S代謝酶的調控 正如上所述，L-/D-DES、SiR、CAS、OAS-TL、碳酸酐酶（Carbonic anhydrase，CA）和CS是H2S代謝的關鍵酶?；铙w研究表明，NO處理可提高玉米幼苗中的H2S合成關鍵酶LCD的活性，繼而提高玉米幼苗中H2S的水平，從而提高玉米幼苗的耐熱性［32］。類似地，在H2O2誘導的玉米幼苗耐熱性形成中，H2O2首先引發NO信號，繼而誘導內源H2S的產生，最終誘發耐熱性的形成［33］。這些暗示，在植物耐熱性形成中，H2S在NO的下游發揮其信號分子作用。

滲透脅迫下，在小麥幼苗中，NO處理幼苗，可增強LCD、DCD和OAS-TL活性，從而引起H2S含量的增加和Cys的動態平衡［34］。此外，在滲透脅迫下，NO的積累可刺激下游信號分子H2S含量的增加，繼而激活細胞的氧化防御系統，即APX、GR、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、SOD和CAT的活性，繼而降低氧化損傷［34］。

在鎘脅迫下，外源施加NO供體SNP或H2S供體NaHS，均能改善鎘脅迫下狗牙根的耐受性［35］。此外，NO誘發的內源H2S的積累和鎘脅迫耐性被H2S合成抑制劑炔丙基甘氨酸（DL-propargylglycine，PAG）和清除劑HT所阻斷［35］。類似地，NO清除劑2-（4-羥基-2-苯基-4，4，5，5-四甲基咪唑-1-氧基-3-氧 化 物（2-（4-carboxy-2-phenyl）-4，4，5，5-tetramethylinidazoline-1-oxyl-3-oxide，cPTIO）處理鎘脅迫的植株，內源H2S含量明顯降低［35］。以上結果表明，在鎘脅迫耐性形成中，NO在H2S的上游發揮信號作用。

在番茄幼苗側根生長的研究中，NO和H2S都參與番茄側根的生長，而SNP與HT或PAG同時處理番茄幼苗，則抵消NO促進的側根生長。NaHS和cPTIO同時處理番茄幼苗，則不影響NaHS對側根生長的促進作用［36-37］。結果表明，H2S作用于NO的下游，促進番茄幼苗的側根生長。

此外，在氣孔運動中，ETH能提高LCD和DCD活性，進一步提高模式植物擬南芥保衛細胞中的H2S水平，繼而激活NO合成關鍵酶NR的活性，從而提高保衛細胞中的NO含量，最終導致氣孔的關閉，暗示在氣孔運動中NO在H2S的下游發揮信號作用［38］。

3.4 H2S和NO調控其他信號途徑

除了上述化學反應、作用于共同的靶分子和調節彼此代謝酶外，H2S和NO的交互作用也可通過調節其它的信號途徑來實現。在對草莓幼苗耐熱性研究中，NaHS不僅可以誘導GSH和抗壞血酸（Ascorbate acid，AsA）合成酶基因的表達和對應抗氧化劑含量的提高，也可觸發APX、CAT、SOD和GR的基因表達和對應抗氧化酶活性的增加，緩解高溫脅迫下生物膜的過氧化產物丙二醛、H2O2和NO的積累，

繼而減少植株內NO的含量，最終提高草莓幼苗對高溫脅迫的抵抗能力［39］，暗示H2S和NO可共同調控植物耐熱性形成途徑。研究也表明，在玉米幼苗和煙草細胞中，H2S和NO分別處理都可提高幼苗［32，40-41］和細胞［42］的耐熱性，并且這種耐熱性的獲得與抗氧化系統活力的增強密切相關，也進一步支持H2S和NO可共同調控植物耐熱性形成途徑的猜想。此外，H2S和NO都可引發Ca2+、ROS、cAMP、MAPK等信號，進一步調控植物的生長發育及響應和適應環境脅迫［27，43-46］。

4 展望

作為重要信號分子的H2S和NO，對植物生長發育和環境脅迫的響應和適應，起著重要的作用。在這些生理過程中，不僅涉及H2S和NO信號的獨立作用，而且涉及二者的交互作用。H2S和NO信號的交互作用常常表現為累加作用或拮抗作用。這種累加或拮抗作用，通常通過H2S與NO的反應、作用于共同的靶分子、調節彼此代謝酶及其它信號途徑等來實現。H2S和NO信號的交互作用主要來源于活體試驗和離體試驗，但二者的交互作用在活體內和離體條件下，是否完全一致，需要進一步的證實。此外，H2S和NO信號的交互作用對植物生長發育及環境脅迫的響應和適應的生理生化及分子機理，有待于進一步闡明。再者，隨著組學（包括基因組、轉錄組、蛋白組、代謝組和表型組等）和測序技術的發展，H2S、NO及二者的交互作用引發的轉錄組、蛋白組、代謝組和表型組的響應，需要進一步的解析。雖然許多研究表明，H2S和NO可通過多條途徑發生交互作用，但由于信號途徑的復雜性和信號網絡的形成，信號分子之間的交互作用在不同植物、不同植物器官類型、不同環境條件下、不同的信號強度，以及植物的不同環境經歷，可能表現不同的累加或拮抗效應，這些仍需進一步剖析。