Leptin過表達對豬前脂肪細胞脂滴形成的研究

胡瀕月 胡楊 成文敏 趙素梅 趙紅業，4 魏紅江

（1. 云南省動物基因編輯與體細胞克隆技術重點實驗室，昆明 650201；2. 云南農業大學動物科學技術學院，昆明 650201；3. 云南農業大學植物保護學院，昆明 650201；4. 云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，昆明 650201）

在全球范圍內，肥胖癥患者呈逐年上升的趨勢，已嚴重危害著人類健康。肥胖是世界范圍內共同關注的社會性健康問題，也是世界各國致力解決的重大難點問題［1］。肥胖發生的直接原因是由于脂肪組織的過度沉積造成的。人和動物體內脂肪的沉積過程類似，一方面是脂肪組織細胞內脂肪不斷合成、蓄積的過程；另一方面是脂肪組織中脂肪細胞的不斷分化過程，這兩個過程的協調統一是脂肪組織形成的基礎，而脂肪組織的主要功能是為機體蓄積能量，但脂肪組織的過度增殖和脂肪的過度蓄積可導致人類肥胖和體脂的過度沉積［2-3］。當前，關于脂肪組織的沉積代謝規律的研究多使用3T3-L1前脂肪細胞系、大鼠原代脂肪細胞及肥胖鼠模型的原代脂肪細胞或脂肪組織、豬血管基質細胞的原代培養前脂肪細胞為材料［4-5］。豬可作為理想的人類疾病動物模型，但迄今為止，以轉入目的基因的方式構建人類肥胖動物疾病模型來研究脂肪組織或細胞的沉積代謝規律及其相關功能基因的調控機制研究還未見報道。

Leptin又名瘦素、瘦蛋白、抗肥胖因子、苗條素，是由肥胖基因編碼、脂肪細胞分泌的一種激素樣蛋白質，具有調節動物攝食行為、增加能量消耗、抑制脂肪合成、促進脂肪分解和降低采食量的作用［5］，并能維持正常的脂類代謝和機體的能量平衡［6］，其作為一種脂肪細胞分泌的激素蛋白，在維持脂肪組織質量穩態中發揮著重要作用。有大量研究證實，Leptin可提高脂肪細胞的脂肪分解［7-9］。也有人報道，Leptin可通過下丘腦利用組織特異性方式調節外周組織中葡萄糖和脂質代謝［10］。體內Leptin的濃度與體脂儲存的多少有關，且影響著脂肪細胞的大小［11-13］。Leptin受體蛋白可在包括脂肪細胞在內的多種組織中大量表達，表明Leptin可能通過自分泌的受體信號來調節脂肪組織代謝活動［14］。在體外，Leptin可降低組織中脂肪細胞的生成，增加甘油三酯水解，促進脂肪酸的氧化［15］。Leptin表達水平的增加能促進棕色脂肪組織［16］和白色脂肪組織［7］的交感神經傳出脂肪酸的分解信號，從而可促進脂肪分解［8-9］。Shimabukuro等［17］的研究報道，在脂肪組織和成熟的脂肪細胞中，Leptin可促進甘油三酯分解。也有報道，脂肪細胞內Leptin基因的表達量與細胞內脂類的含量和脂肪細胞的大小密切相關［18］。攜帶有低水平Leptin表達的ob/ob鼠盡管其血漿瘦蛋白含量可維持在正常水平，但仍可導致ob/ob鼠產生肥胖［19］，這表明降低脂肪組織內的Leptin基因表達可導致動物發生肥胖癥。基于前人的這些相關報道，Leptin與脂質代謝的相關機制仍不清楚，尤其在利用過表達Leptin基因的方式構建豬等大動物模型來研究Leptin與脂質代謝相關的功能基因的調控機制也尚未被報道。

動物機體攝入過多的能量后，肝臟能將多余的能量通過形成脂肪或以中性甘油三酸酯（Triacylglycerol，TAG）的形式有效地沉積在脂肪組織中，前脂肪細胞是動物體內終生存在的一類具有增殖和脂肪細胞定向分化能力的特異化前體細胞［20］，中性TAGs在脂肪細胞中的不斷積累造成脂滴不斷增大，而脂肪細胞通過分泌Leptin能夠有效抑制甘油三酯的合成。動物機體脂肪的代謝還受脂質代謝通路相關基因的調控。有報道，PPARγ與脂肪代謝和脂滴形成密切相關，是PPARs家族成脂能力最強的亞型［21］。SREBPs裂解激活蛋白SCAP（SREBPs cleavage-activating protein，SCAP）用來控制SREBPs的激活。SCAP是處于內質網的一種膜蛋白，同時SCAP能與SREBPs在內質網形成復合物，參與甘油三酯的合成［22-24］。TAG合成涉及酰基轉移酶將酰基脂肪酸轉移至活化的甘油主鏈，酰基轉移酶包括3-磷酸甘油酰基轉移酶（GPAM），1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基轉移酶6（AGPAT6）［25］。另外，PLIN2基因在多種組織中廣泛表達，是形成細胞脂滴的結構蛋白，能夠刺激脂質的聚集和脂滴的形成［26］。本研究基于實驗室前期Leptin過表達豬的研究基礎［27］，通過分離培養Leptin過表達豬和野生型豬前脂肪細胞進行傳代培養，并誘導分化形成脂滴，通過油紅O及Bodipy染色觀察脂滴的形態，統計分析脂滴形成的數量及脂質含量，進一步利用Q-PCR檢測分析脂質合成代謝相關基因mRNA的表達情況，旨為進一步闡明人類肥胖發生發展的分子機理研究奠定一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

所用Leptin過表達和野生型豬皮下前脂肪細胞均與實驗室已發表文章［27］中的豬為同一個體。

1.2 方法

1.2.1 豬前脂肪細胞分離和傳代培養 通過外科手術法從成年的Leptin過表達豬（Leptin）和野生型豬（control）皮下獲取脂肪組織，立即將其浸入含有5%青霉素-鏈霉素溶液（PS）溶液中，置于碎冰中運送到實驗室。用無菌PBS（含5%PS）洗滌3次，用不含PS的PBS洗滌，然后用眼科剪將脂肪組織充分剪碎并轉移到加有2 mL膠原酶I的T-25瓶中，置于38℃二氧化碳培養箱中消化約1.5 h，室溫1 500 r/min、3 min離心3次，收集細胞沉淀，用10%FBS、1%PS的DMEM完全培養液重懸后轉移到35 mm培養皿中，置于38℃，5%CO2的培養箱中進行傳代培養，2 d更換一次完全培養基。按照標準方案［28］誘導第3至第5代的豬前脂肪細胞進行分化，具體將豬前脂肪細胞傳代接種在35 mm培養皿中并增殖至匯合度達50%-60%時，使用分化液（含有10%胎牛血清，0.87 μmol/L胰島素，1 μmol/L地塞米松，0.25 mmol/L IBMX、1 μmol/L羅格列酮）誘導分化，此時記為0 d，誘導2 d后，將分化液替換為維持培養基（含有10%胎牛血清，0.87 μmol/L胰島素，1 μmol/L地塞米松和1 μmol/L羅格列酮的DMEM培養基）促使其繼續分化，此后每2 d更換一次新鮮的維持培養基，分別在誘導分化后第0、4、6、8、10和14天時收集細胞用于后續相關實驗。

1.2.2 脂滴Bodipy染色 將前脂肪細胞誘導第0、4、6、8、10和14天進行脂滴Bodipy染色，棄去培養基，PBS洗滌細胞1次，并用含4%多聚甲醛的PBS溶液在室溫下固定30 min，用PBS洗滌3次，滴加600 μL Bodipy工作液（將1 mg/mL儲存液按1∶1 000用PBS稀釋，工作液需避光4℃保存）。室溫染色15 min后用PBS洗滌細胞3次，立即在熒光顯微鏡下觀察并拍照，用ImageJ統計分析脂滴面積。

1.2.3 脂滴的油紅O染色和脂質含量測定 分別選取誘導分化第0、4、6、8、10和14天的前脂肪細胞，棄去培養基，用PBS洗滌細胞1次，加入4%多聚甲醛在室溫下孵育30 min，接著用PBS洗滌細胞3次，加入油紅O工作液（將3.5 mg/mL的貯存液按6∶4用H2O稀釋），室溫下染色30 min，用PBS洗滌細胞3次，在顯微鏡下觀察細胞并拍照。每個培養皿中加入等體積的異丙醇及4%NP-40進行萃取，并在充分混合后使用全波長酶標儀測量520 nm處的吸光度值。

1.2.4 RNA提取及Q-PCR檢測相關基因mRNA表達水平 用TRIzol提取總RNA，使用Prime-Script RT試劑盒從總RNA合成cDNA，用Q-PCR評估脂滴分化及脂質合成代謝相關基因的mRNA表達水平。Q-PCR實驗使用的PCR引物（表1）由Primer 5.0軟件設計，并由北京擎科生物技術有限公司合成。20 μL Q -PCR反應體系：2×SYBR Green Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL，10 μmol Forward primer 1 μL，10 μmol Reverse primer 1 μL，cDNA 1 μL。Q -PCR特異產物通過溶解曲線分析，相對Ct值法即X = 2-ΔΔCt測定相對基因表達變化。

表1 Q-PCR所用引物序列表

1.2.5 統計學分析 本研究中所有的實驗數據均以平均值±標準誤（x-±s 表示，采用t檢驗進行統計學分析，#，*P＜0.05為差異顯著；##，**P＜0.01為差異極顯著），作圖采用GraphPad Prism 7軟件。

2 結果

2.1 Leptin過表達對豬前脂肪細胞誘導分化形成脂滴的影響

誘導分化后，Leptin過表達豬前脂肪細胞和野生型豬前脂肪細胞的分化進程存在差異（圖1）。0 d時均呈現梭型，2 d后細胞開始膨脹，從原始的梭形逐漸形成球形，呈現出“環狀”。第4天野生型細胞內生成的微小脂滴已匯集成多個小脂滴，而Leptin過表達細胞僅出現微小脂滴。直到第14天，Leptin過表達豬前脂肪細胞脂滴的生長才與野生型趨于一致，表明Leptin過表達豬前脂肪細胞分化形成脂滴的進程慢于野生型豬前脂肪細胞。

2.2 Leptin過表達對豬前脂肪細胞誘導分化過程中脂質合成的影響

根據Bodipy染色結果（圖2-A，2-D），第4天時，野生型豬前脂肪細胞中的熒光強度明顯高于Leptin過表達豬前脂肪細胞。之后第6天時兩者細胞表達量仍然存在差異，直到14 d時，Leptin過表達的豬脂肪細胞與野生型豬脂肪細胞表達量也不相同。進一步，用油紅O染色觀察后再用異丙醇和NP-40萃取脂肪細胞中的甘油三酯進行吸光度測定（圖2-B，2-C），結果與熒光強度值相符。從4-10 d，Leptin過表達豬前脂肪細胞的脂質形成顯著低于野生型豬前脂肪細胞（P＜0.05），直到誘導分化后第14天，Leptin過表達豬前脂肪細胞甘油三酯的含量與野生型豬的前脂肪細胞甘油三酯的含量趨于一致（P＞0.05）。

2.3 Leptin過表達對豬前脂肪細胞誘導分化形成脂滴過程中脂質代謝相關基因mRNA表達水平的影響

圖1 Leptin過表達豬前脂肪細胞與野生型豬前脂肪細胞誘導分化形成脂滴的情況

圖2 Leptin過表達與野生型豬前脂肪細胞誘導分化過程中脂質合成含量測定結果

Q-PCR結果顯示，Leptin過表達豬前脂肪細胞中Leptin的表達量顯著高于野生型豬前脂肪細胞（P＜0.05）（圖3-A）。進一步利用Q-PCR檢測了誘導0 d和4 d后的豬前脂肪細胞中脂質調節相關基因的表達情況。經過4 d誘導后，在3個脂質代謝相關的核轉錄因子，PPARγ和SREBP1的表達在野生型豬前脂肪細胞中極顯著升高（P＜0.01），SCAP的表達水平顯著升高（P＜0.05）；而在Leptin過表達豬前脂肪細胞中PPARγ的表達水平顯著升高（P＜0.05），SREBP1和SCAP的表達無明顯變化（P＞0.05）。與野生型相比，開始誘導時，Leptin過表達豬前脂肪細胞中PPARγ基因的表達呈現極顯著低的水平（P＜0.01）；誘導4 d后，在Leptin過表達豬脂肪細胞中，以上3個基因的表達均極顯著降低（P＜0.01）（圖3-B）。這些結果表明，Leptin過表達抑制了脂質代謝通路中轉錄相關基因的表達。同時，誘導4 d后，脂肪酸轉位酶FAT-CD36和脂蛋白酯酶LPL的表達水平在野生型和Leptin過表達豬前脂肪細胞中均極顯著升高（P＜0.01）。與野生型組相比，開始誘導時，在Leptin過表達豬脂肪細胞中FAT-CD36基因的表達均呈現極顯著低的水平（P＜0.01）；誘導4 d后，在Leptin過表達豬前脂肪細胞中，FAT-CD36的表達仍顯著低于野生型（P＜0.05），LPL的表達極顯著低于野生型（P＜0.01）（圖3-C）。

在誘導第4天時，3個TAG合成的相關基因AGPAT6、GPAM和PLIN2的表達水平在野生型豬前脂肪細胞均極顯著升高（P＜0.01），而在Leptin過表達豬前脂肪細胞中AGPAT6和PLIN2的表達水平極顯著升高（P＜0.01），GPAM的表達水平無顯著變化。與野生型相比，開始誘導時，在Leptin過表達豬前脂肪細胞中的上述3個基因的表達均無顯著變化（P＞0.05）；誘導4 d后，在Leptin過表達豬前脂肪細胞中以上3個基因的表達均呈現極顯著降低的水平（P＜0.01）（圖3-D）。這些結果表明，Leptin過表達抑制了脂質合成轉錄相關基因、TAG合成相關基因以及長鏈脂肪酸攝取相關基因的表達。

3 討論

Leptin是由脂肪細胞分泌的細胞因子，對脂質代謝調節具有重要的作用［5］。因缺少理想的肥胖實驗動物模型，肥胖及體脂過度沉積發生的分子機制研究主要通過添加外源性Leptin的前脂肪細胞系體外分化進行研究。肥胖型ob/ob鼠是目前常用的肥胖實驗動物模型，該鼠是由于OB基因缺陷而引起的先天性肥胖，但嚙齒類動物和人在基因組和機體代謝上存在較大差異，其作為研究人肥胖的動物模型存在缺陷，因此需更理想的動物模型來研究人肥胖發生的分子機制。豬與人在解剖和生理代謝特點方面非常相似，對豬、人、鼠OB基因的研究表明，豬與人OB基因的同源性為88.5%［31］，鼠與人OB基因的同源性為83%［32］，本實驗室前期已成功構建了過表達Leptin基因的豬模型，體外實驗結果表明，6月齡野生型豬體重約為轉Leptin基因豬體重的2.5-3.3倍，ELASA檢測轉Leptin基因豬血清中的Leptin水平顯著高于野生型（P＜0.05）［27］。Ke等［33］的研究表明低脂肪率與脂肪細胞中甘油三酯的合成與儲存減少有關。因此，基于豬與人同源性高的優點，我們選擇豬構建人類疾病的肥胖模型，并進一步成功構建了過表達Leptin基因豬模型，將更好地模擬人類肥胖疾病的發生，進而為揭示肥胖疾病發生發展相關的甘油三酯等代謝機制研究奠定了一定的理論基礎。

在3T3-L1細胞系培養基中添加5-500 ng/mL外源性Leptin，可抑制脂質積累［34］，提示Leptin在一定程度上能影響動物機體脂質的積累和脂肪細胞中TAG的積累。脂肪細胞的生成和分化還受激素、細胞間、細胞與間質間相互作用的轉錄因子的調控［35-37］，如PPAR、SREBP1c等［38-42］。PPARγ主要在脂肪組織中參與脂肪細胞的分化，是誘導脂肪細胞分化的特異性轉錄因子，在脂肪細胞分化過程中，表達水平不斷上升，對脂肪細胞的分化起著重要作用［43-44］。Kim等［45］研究發現SREBP1能促進小鼠脂肪細胞系3T3LI前脂肪細胞脂滴的積累，加速前體脂肪細胞的分化進程。Cabrero等［46］通過重組人Leptin處理原代培養人源單核巨噬細胞24 h，發現PPARγmRNA表達下調。本實驗研究結果表明，過表達Leptin可抑制脂滴數量增加，在一定程度上致使甘油三酯的合成速率降低，并可促進PPARγ、SREBP1、SCAP基因的下調，這與前人所報道的結果一致，Leptin可抑制脂肪細胞分化和增殖，其機制可能是通過下調PPARγ、SREBP1、SCAP基因的表達來抑制脂肪細胞的分化和代謝。

脂肪細胞的分化過程在激素誘導的培養體系中4 d內完成，在分化的早期階段進入細胞周期，經1-2次有絲分裂之后永久地退出細胞周期，開始蓄積脂滴，經過終末分化階段分化為成熟脂肪細胞［47-48］。脂肪酸是合成甘油三酯的重要原料，有研究表明，FAT/CD36可將LCFA運輸到脂肪細胞中［15］，過表達FAT/CD36可增強脂肪酸的轉運，而LPL是脂肪細胞早期分化的標志［49］。本實驗研究結果表明，Leptin過表達豬前脂肪細胞中LPL和FAT/CD36基因的mRNA表達水平顯著降低，與上述所報道的研究結果一致，表明Leptin在一定程度上可通過下調FAT/CD36、LPL基因的表達進而抑制LCFA的運輸和脂肪細胞的分化。也有研究報道，在脂肪細胞分化的初期階段，Leptin可抑制脂肪細胞脂肪酸的合成，從而減少脂肪沉積，PLIN2（Adipophilin）位于脂滴表面，還與脂滴的儲存密切相關［50-51］。外源性添加10 ng/mL Leptin可有效減少大鼠脂肪細胞TAG的積累［15］。PPARγ特異性激活劑羅格列酮（Ros）與Leptin聯合處理大鼠脂肪細胞，發現能有效減弱Leptin對PPARγ、PLIN2的mRNA表達的下調作用［6］。本研究結果顯示，過表達Leptin豬前脂肪細胞TAG合成的相關基因（GPAM，AGPAT6）與脂滴儲存相關基因PLIN2的mRNA表達水平均下調，與前人所報道的結果相一致，表明Leptin可通過下調TAG合成相關基因的表達及PLIN2基因的mRNA下調來抑制脂質的儲存和積累。

圖3 Leptin過表達豬前脂肪細胞和野生型豬前脂肪細胞誘導分化形成脂滴過程中脂質合成代謝相關基因mRNA的表達水平

4 結論

在豬前脂肪細胞誘導分化形成脂滴的過程中，Leptin可通過下調脂質合成相關基因的表達水平來抑制前脂肪細胞分化形成脂滴的進程，降低脂肪細胞中甘油三酯的合成，從而在一定程度上降低動物機體內脂質合成的速率，進而降低動物機體內脂質的沉積，將為研究人類肥胖的發生發展過程及機制奠定理論基礎。