高通量測序技術解析中學校園細菌群落的特征組成

黃婷 方源 馮舟 沈和 聶勇 鄭鑫 汪家權 許子牧

（1. 合肥工業大學資源與環境工程學院，合肥 230009；2. 北京大學工學院，北京 100871；3. 北京師范大學附屬實驗中學，北京 100032）

生存場所中的各種致病或條件致病微生物的污染給人類的健康帶來威脅［1］。在諸多環境中，校園是一個包含有多種場所的特殊環境，是青少年接受課堂教育的主要場所，也是微生物傳播和交流活躍的地方。所以，研究校園環境微生物的組成與功能、有助于了解青少年時期人體微生物組的發育規律，對青少年健康發育和流行疾病的防治具有重要意義。當前，校園環境微生物組學研究是全世界范圍的熱點之一，人們分別利用培養和免培養的方法對校園建筑物內的空氣等方面進行研究。在我國，已報道的對校園環境微生物的研究主要集中于室內空氣、教室教學設施、公用電腦等方面［2-5］。鄧怡卿等［6］利用培養的方法，對上海師范大學教室內的課桌、手把和話筒上的微生物進行培養，結果顯示課桌和話筒的細菌菌落較多，但未發現致病菌。陳宏偉［7］對校園內圖書館自習廳、學生教室、食堂、男女寢室等場所的樣品進行微生物培養，結果顯示各場所空氣微生物污染數量隨人員的密度活動量的增大而增大。然而，傳統的可培養方費力且費時，可靠性也很差［8］。近年來，隨著新一代測序技術的快速發展，可獲得龐大的數據信息，通過現代生物信息學手段，獲得微生物總體群落組成情況，具有高通量、價格低、運行周期短的優勢，已被廣泛應用于微生物群落結構研究［9-11］。總之，目前有限的校園環境研究，主要集中在以下幾個方面：（1）大學校園多有研究，中小學校園中的研究還很缺乏；（2）對不同場所空氣中微生物組成有研究，缺乏對建筑物場所表面微生物的研究。由于很多物質可能在表面的富集，表面上微生物的組成與空氣中可能存在顯著的差異；（3）利用可培養方法，對校園環境微生物組的認識不夠深入。

為此，本研究以一所中學校園作為研究對象，收集校園內不同建筑物場所中樓梯扶手和門把手表面的微生物樣品，通過高通量測序技術獲得微生物群落結構信息，初步探究了校園建筑物的細菌群落組成和分布特征。

1 材料與方法

1.1 材料

采 樣 緩 沖 液：0.15 mol/L NaCl，0.01%（V/V）Tween20（國藥集團化學試劑北京有限公司），于121oC，20 min高壓蒸汽滅菌，100 μL/管；一次性無菌采樣植絨拭子（貨號：5U018S.CN，COPAN公司）；DNeasy Power Soil Kit（DNA提取試劑盒，貨號12888-100，QIAGEN公司）；E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒（OMEGA 公司）；樣品細菌16S rRNA基因V4區高通量測序由廣東美格基因科技有限公司商業完成。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采樣地點為北京市海淀區某中學校園內4個教學樓，2個實驗樓，2個體育館和4個食堂的門把手、扶梯等。本研究共取得12個樣品。取樣時將一次性無菌采樣植絨拭子小心地從試管中旋出，用采樣緩沖液將拭子潤濕后，按一定方向旋轉拭子擦拭采集物表面，平均采樣面積50 cm2，擦拭時間2 min。采集完畢后將拭子放回試管于-20oC保存備用。

1.2.2 DNA提取與16S rRNA基因V4區高通量測序 將采樣后的拭子放入含有緩沖溶液的離心管中攪拌30 s，然后將采集到的樣品重懸至緩沖液中，然后利用QIAGEN的DNeasy Power Soil Kit試劑盒說明書的步驟提取樣品中微生物總DNA。

利用不同的barcode標記的上游引物515F（5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和 下 游 引 物806R（5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3'）對細菌16S rRNA基因V4區進行 PCR 擴增。PCR反應體系（50 μL）：2×Premix Taq 酶25 μL，10 mmol/L上游和下游引物各1 μL，20 ng/μL DNA模板3 μL，補ddH2O至 50 μL。PCR反應程序參數為：94℃ 5 min；94℃30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s，31個 循 環；72℃ 10 min；4℃ Hold。PCR完成后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。利用GeneTools Analysis Software（Version4.03.05.0，SynGene）對PCR產物進行濃度對比后，按照等質量原則計算各樣品所需體積，將各PCR產物進行混合；使用凝膠回收試劑盒回收PCR混合產物，TE緩沖液洗脫回收目標DNA片段。然后，樣品送至廣東美格基因科技有限公司，由其完成文庫構建及Illumina HiSeq高通量測序。

1.2.3 數據處理與分析 將測序原始數據導入QIIME2［12］軟件，利用軟件中DADA2質量控制方法進行去噪，生成序列變體（Sequence variant，SV），選取代表性序列與數據庫進行比對從而獲得物種注釋信息。基于物種注釋信息，去除注釋為葉綠體、線粒體以及不能注釋為細菌的序列變體（SV）及其包含的序列。基于 SV的分析結果，進行樣品微生物α多樣性和β多樣性分析，香農指數（Shannon）表示群落的多樣性，其指數數值越大說明樣本的多樣性就越高。基于Unweighted-Unifrac距離和Weighted-Unifrac距離得到矩陣，運用R軟件進行PCoA（主坐標分析，Principal co-ordinates analysis）分析，并結合置換多元方差分析（Permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）去觀察組間的差異性，其本質是基于F統計的方差分析，依據距離矩陣對總方差進行分解的非參數多元方差分析方法。一般以P＜0.05 為顯著，P＜ 0.01 為非常顯著。

2 結果

2.1 數據質控與物種注釋

將高通量測序得到的原始數據進行整理、過濾、分析后，19個樣品獲得了108萬條有效序列，序列長度介于231 bp - 397 bp 之間，平均約為 253 bp。具體到樣品，每個樣品獲得有效序列數為62 969-125 941條，大部分樣品為70 000至100 000條，平均單個樣品的序列數為89 724條在 100% 的序列相似性水平下，對樣本進行聚類和注釋，共得到3 036個SVs，歸屬于20個菌門，466個菌屬。

2.2 不同場所微生物群落多樣性分析

根據物種預測信息，分析表明：體育館的物種豐富度最高（可觀測SV數為414），其次是實驗樓（可觀測SV為255）和教學樓（可觀測SV為223），最后是食堂（可觀測SV為201）（圖1-B）。與此類似的是，體育館的Shannon指數也最高，其次是實驗樓和教學樓，而食堂的Shannon指數也最低（圖1-A）。為什么體育館的物種豐富度最高而食堂的最低？究其原因，有如下幾種可能：（1）該學校只有一個體育館，到體育館上課的學生數量大于其他10個樣品對應學生數量；（2）在體育館里的活動中，人體運動代謝產生產生更多的汗液、皮脂等等，為微生物生長和繁殖提供了營養物質條件。至于食堂中微生物相對豐度和多樣性指數較低的原因，可能要歸功于食堂中經常進行消毒滅菌。

圖1 不同場所樣品的物種豐富度（SV）和α多樣性分析-Shannon指數

依據上述SV的計算和預測，計算所有樣本基 于SV的Unweighted-Unifrac距 離 和Weighted-Unifrac距離，進行主坐標（PCoA）分析，以圖了解樣品微生物群落的聚類情況和群落結構相似性。Weighted-Unifrac和Unweighted-Unifrac分析的區別在于Unweighted-Unifrac不考慮物種豐度。在PCoA圖中，如果樣本距離越接近，表示物種組成結構越相似。結果顯示，各樣品按照場所用途的不同在第一、二坐標上有明顯區分。從Weighted-Unifrac分析（圖2-A）和Unweighted-Unifrac分析（圖2-B）結果，可以看出：來自于不同場所的樣品微生物群落大體按照場所功能而聚類，例如食堂、實驗樓、體育館、教室樓樣品中微生物群落基本各自聚在一起。進一步利用PERMANOVA相似性分析，結果表明教學區域與食堂之間存在顯著差異，其中Weighted-Unifrac距離下P= 0.017，Unweighted-Unifrac距離下P= 0.006。

圖2 用Unweighted-Unifrac距離和Weighted-Unifrac距離計算的PCoA圖

2.3 不同場所微生物群落組成特征與變化

各樣品基于門水平的細菌組成分布見圖3-A。所有樣品共檢測到20個門，其中變形菌門（Proteobacteria，豐度范圍19.73%-90.40%），厚壁菌門（Firmicutes，豐度范圍1.67%-56.19%）和放線菌門（Actinobacteria，豐度范圍0.83%-16.88%）的相對豐度較高。各場所之間的物種組成相似，但微生物豐度有較大差異。其中變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）存在于所有建筑物場所，尤其是變形菌門（Proteobacteria）的物種豐富度占據絕對優勢，在食堂3和食堂4中發現厚壁菌門（Firmicutes）的豐度顯著高于其他場所樣品。說明在校園各建筑物場所之間，由于人員流動，這些優勢物種在接觸過程中進行了交流。

在 屬 水 平 上（圖3-B），一 共 檢 測 到466個 SV，相對豐度較高的SV主要屬于棲水菌屬（Enhydrobacter，豐度范圍0.49%-56.26%），鏈球菌屬（Streptococcus，豐度范圍0.36%-17.63%），葡萄球菌（Staphylococcus，豐度范圍0.53%-11.26%）等。相較于門水平上微生物群落差異不顯著，各樣品在屬水平的物種分布呈現出較大的個體差異，如教學樓相對豐度前5的菌屬有異球藻科（Xenococcaceae），鏈球菌屬（Streptococcus），棲水菌屬（Enhydrobacter），葡萄球菌（Staphylococcus），甲基桿菌屬（Methylobacterium）。實驗樓相對豐度前5的菌屬有棲水菌屬，葡萄球菌，馬賽菌屬（Massilia），副球菌屬（Paracoccus），棒狀桿菌屬（Corynebacterium）。體育館相對豐度前5的菌屬有異球藻科，馬賽菌屬，微紅微菌屬（Rubellimicrobium），小雙孢菌屬（Microbispora），副球菌屬（Paracoccus）。食堂相對豐度前5的菌屬有棲水菌屬，氣球菌屬（Aerococcus），鏈球菌屬，不動桿菌屬（Acinetobacter），葡萄球菌。在各場所相對豐度前5的菌屬中發現教學樓獨有的優勢菌屬有甲基桿菌屬，實驗樓獨有的優勢菌屬有棒狀桿菌屬，體育館的優勢菌屬有微紅微菌屬和小雙孢菌屬，食堂的優勢菌屬棲水菌屬，氣球菌屬。Venn 圖分析結果表明，在屬水平下，4種用途的建筑物中有 94個共有菌屬，教學樓、實驗室、體育館和食堂各自獨有的菌屬分別為 47 個、28個、88 個和 43 個（圖4-A）。可以看出體育館扶手表面的微生物物種多樣性顯著高于其他3個場所設施表面微生物。各場所內部樣品的Venn 圖反映了建筑物內部的相似菌屬與各自獨有的菌屬（圖4-B-E）。

圖3 各樣品基于門與屬水平的細菌組成

雖然在不同組別樣品中都發現棲水菌屬，但在小食堂中其豐度顯著高于其他組的樣品。并發現大食堂樣品中氣球菌屬為優勢菌屬，而在其他場所中并未發現有此情況。推測這與大食堂供應的菜品有關，蔬菜肉類等會攜帶某些菌群，在接觸過程中導致細菌發生交流，從而在大食堂內占據較高豐度。

圖4 各建筑物場所屬水平下Venn圖

3 討論

本研究采用高通量測序的方法研究了校園內不同場所中微生物群落的組成特征。發現校園細菌群落的分布具有按場所用途進行區分的特征。體育館的物種豐富度顯著高于其他場所，而食堂的Shannon指數顯著低于其他場所。體育館是青少年運動的場所，運動過程中產生的汗液和豐富的皮脂給微生物提供了生長發育的有利條件。食堂作為飲食場所，消毒和衛生應是各場所之間最為嚴格的，這也是導致其微生物的多樣性較低的原因。其次，教學活動頻繁的區域越有可能更容易發生物種的交流，集體教學活動可能是影響校園建筑物微生物群落特征的主要原因。密集的人員活動會增加微生物的傳播幾率，從而提高公共區域微生物的多樣性與穩定性。

物種群落組成結果表明，在門水平上，變形菌門，厚壁菌門和放線菌門構成樣品微生物群落的主要微生物，這些微生物在其他場所環境中也廣泛分布，是不同場所設施表面主要的微生物組成［13］。不同功能區微生物群落特征和豐度分布有顯著差異，最為優勢的變形菌門相對豐度為食堂＞實驗室＞教學樓＞體育館。在屬水平上，棲水菌屬，鏈球菌屬，葡萄球菌構成樣品微生物群落的主要微生物［14］。有報道指出在前臂、手等部位這些微生物種類相對豐富［15-16］，說明這些物種通過人手部的接觸在各場所設施表面之間進行了交流，導致在各場所之間廣泛分布。葡萄菌屬是報道中的絕對優勢菌屬［17］，且葡萄球菌屬的部分菌株是引起人類化膿性感染的常見病原菌［18］。甲基桿菌屬（Methylobacterium）分離于土壤、塵土、淡水、湖泥、葉表等環境［19］。此類菌屬在初一1-2層扶梯出現較多，可能是學生在室外活動回教室的過程中沒有洗手，在上樓過程中與樓梯扶手產生接觸使該菌屬產生交換。棒狀桿菌屬（Corynebacterium）寄生于人鼻腔、咽喉、眼結膜和皮膚等處，當人體抵抗力下降時，可引起化膿性感染、肺炎等疾病［20］。在空氣細菌樣品中發現甲基桿菌屬，馬賽菌屬（Massilia），副球菌屬（Paracoccus），微紅微菌屬（Rubellimicrobium）為優勢菌屬［21］，這類菌屬在體育館樣品中相對豐度較高，由于體育館是相對封閉的空間，這類細菌在進入空氣后由于環境適宜，學生活動又產生汗液等營養物質給這類菌提供了良好的生存環境。小食堂出現最多的棲水菌屬是人體皮膚中的優勢菌屬［22］，且在魚類等水產中分布較廣［23］，可能由于小食堂供給魚類等水產食物時，廚師直接與食物接觸后又觸碰其他物品，通過人員流動，手觸碰餐具、桌椅、把手等公共物品時，手部微生物與物體表面微生物進行交流，導致小食堂內該菌屬微生物豐度最高。在大食堂發現的氣球菌屬，該菌廣泛分布于空氣、腌肉的鹽水及蔬菜等上［24］，而食堂正是蔬菜肉類等食物的供應場所。不動桿菌屬（Acinetobacter）廣泛分布于自然界和人體的皮膚表面［25-26］，常可引起肺炎腦膜炎、菌血癥等各種難治性感染［27］。因此，在學校的日常教學活動和飲食生活中，學校要加強對校園公共區域衛生的管理，對學生做好衛生教育和知識普及，養成良好的衛生習慣，從而降低流行性疾病的傳播幾率。

4 結論

本研究主要研究中學校園不同場所的微生物群落構成，發現微生物群落構成與場所功能相關。本研究僅在不同場所設施表面進行了采樣，分析其群落結構和多樣性，但對于不同時間段各點的微生物群落特征并未做進一步研究，下一步有待完善不同時間點各場所微生物群落的結構和多樣性，進而為校園衛生安全提供更有利的依據。