網果酸模HPLC指紋圖譜研究

嚴光俊 許京 王瑞海 苗青 郭昌洪 張維 劉麗梅

蓼科酸模屬植物網果酸模RumexchalepensisMill.(又名紅絲酸模)的干燥根及根莖，地方臨床藥用稱之為金不換，始載于《中藥志》，主要分布在湖北、江西、河南、浙江及安徽等地[1-4]，其具有清熱解毒、通便、殺蟲之功效，民間用于止血和治療痢疾[5]。

網果酸模為地方草藥，多為栽培品，有關網果酸模化學成分報道較少[6-8]，有效成分報道僅有酸模素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等，有限的幾個成分很難全面概括或評價其質量[9]。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的色譜鑒定手段，該技術已被廣泛用于中藥的質量控制領域，因其可較全面地反映中藥材及植物藥產品的藥效學物質特征，評價其穩定性及一致性而受到國際的認可[10-11]，目前，未見有網果酸模HPLC指紋圖譜相關報道。故本實驗運用中藥指紋圖譜技術，首次建立了網果酸模HPLC指紋圖譜，使用相似度對不同地塊、不同采收年限、不同采收季節網果酸模樣品進行分析，為網果酸模質量標準的建立提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100系列，包括G1322A脫氣機，G1311A四元泵，G1313A自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1315B DAD檢測器，HP化學工作站。Agilent Extend- C18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm，美國安捷倫)，SB-5200DT超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，CP2202S電子天平(瑞士梅特勒-托利多)。

1.2 藥物與試劑

大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷對照品(批號：PS010712)、酸模素對照品(批號：PS170608-03)、大黃素對照品(批號：PS000259)、大黃酚對照品(批號：PS010475)、大黃素甲醚對照品(批號：PS000263)均購自成都普思科技股份有限公司。大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品(批號：AF8032001)購自成都埃法生物科技有限公司。

乙腈、甲醇、甲酸為色譜純(Fisher 公司)，其他試劑均為分析純，水為純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

16批網果酸模采自湖北省荊州市公安縣章莊鋪鎮，經黑龍江中醫藥大學王振月教授鑒定為網果酸模，去掉根莖殘基，根及根莖洗凈，切片，陰干，得其飲片。具體信息見表1。

表1 16批湖北省荊州市章莊鋪鎮網果酸模采樣信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Agilent SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，254 nm波長處二極管陣列檢測器檢測，流動相：甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～40分鐘，35%→60%A；40～65分鐘，60%→95%A；65～70分鐘，95%→100%A)，流速1 mL/分鐘，柱溫為室溫，進樣量為5 μL，分析時間為70分鐘。該條件下得到的網果酸模指紋圖譜色譜峰多且分離度好。見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

取大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷對照品2.08 mg、大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品2.49 mg、大黃素甲醚對照品2.51 mg分別置于10 mL容量瓶中；酸模素對照品3.03 mg、大黃素對照品2.09 mg、大黃酚對照品2.61 mg分別于5 mL量瓶中，精密稱定，加適量二氯甲烷溶解，加甲醇分別制成每1 mL含大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、酸模素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚分別為208 μg、249 μg、251 μg、606 μg、418 μg和522 μg的溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取網果酸模粉末(過50目篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇40 mL，稱定重量，超聲1小時，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取同一份供試品溶液(S1)，在“2.1”項色譜條件下進樣6 次，以酸模素為參照峰，各共有峰相對保留時間及相對峰面積的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)均小于5%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 取同一份供試品溶液(S1)，在“2.1”項色譜條件下于 0、2、4、8、12、24小時進樣，以酸模素為參照峰，各共有峰的相對保留時間及相對峰面積RSD均<5%，表明24 小時內供試品溶液的成分是穩定的。

2.4.3 重復性試驗 取同一批樣品(S1)，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，以酸模素為參照峰，各共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均<5%，表明重復性良好。

2.5 參照峰的選擇

酸模素色譜峰(4號峰)為所有樣品中共有，而且與相鄰峰分離度良好，出峰時間適中，峰面積較大，故選擇其作為參照峰。

2.6 網果酸模指紋圖譜的建立

2.6.1 相似度分析 將16批樣品以 AIA 格式依次導入至國家藥典委員會 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統 2008版” 軟件，以 S8 為參照圖譜，時間窗口設置為0.10，經多點校正和數據匹配，以中位數法生成對照指紋圖譜(圖2)，平均相似度為91.3%

2.6.2 共有峰標定及化學成分指認 精密吸取對照品、供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定。將對照品、樣品的色譜峰保留時間及色譜圖進行分析，指認了其中6種成分，分別為大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷(2號)、大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷(3號)、酸模素(6號)、大黃素(8號)、大黃酚(9號)、大黃素甲醚(10號)，具體見圖2。

圖1 網果酸模HPLC色譜圖

注： 2號峰:大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷;3號峰:大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷; 6號峰:酸模素;8號峰:大黃素;9號峰:大黃酚;10號峰:大黃素甲醚。

2.6.3 不同地塊樣品指紋圖譜分析 將“1號”“2號”“3號”地塊樣品以 AIA 格式依次導入至國家藥典委員會 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統 2008版”軟件，計算不同地塊網果酸模指紋圖譜相似度，結果見表2。

表2 不同地塊網果酸模指紋圖譜相似度計算結果

2.6.4 不同生長年限指紋圖譜分析 將1年生、 2年生、 3年生樣品以 AIA 格式依次導入至國家藥典委員會 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統 2008版”軟件，計算不同年限網果酸模指紋圖譜相似度，結果見表3。

表3 不同年限網果酸模指紋圖譜相似度計算結果

2.6.5 不同采收季節樣品指紋圖譜分析 將春季、秋季樣品以 AIA 格式依次導入至國家藥典委員會 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統 2008版”軟件，計算不同采收季節網果酸模指紋圖譜相似度，結果見表4。

表4 不同采收季節網果酸模指紋圖譜相似度計算結果

3 討論

通過對提取方法(超聲、回流提取)、不同的提取溶劑和提取時間的考察，并結合有關文獻確定了本節“2.3”項下供試品溶液的制備方法。

通過對色譜柱、流動相、檢測波長的考察，發現本節“2.1”項下HPLC色譜條件下指紋圖譜信息量最大，且各色譜峰分離較好。

通過計算相似度并進行分析，對比分析不同地塊、不同年限、不同采收季節的網果酸模HPLC指紋圖譜。結果顯示2號地塊相似度97.4%、3號地塊相似度94.2%、1號地塊相似度92.3%，盡管這三個地塊均在湖北省荊州市公安縣章莊鋪鎮，但三塊地指紋圖譜相似度還是有一定差異，說明網果酸模生態環境影響其相似度。網果酸模隨生長年限增加，共有峰減少，相似度呈減少趨勢，2年生相似度較低，可能與樣品量少有關；網果酸模春季采收其指紋圖譜相似度略高于秋季采收，說明春季采挖對于保證其質量更有利。

本實驗建立了16批次網果酸模HPLC指紋圖譜，平均相似度>90%，不同地塊、不同年限、不同采收季節網果酸模HPLC指紋圖譜，雖有差異，但相似度均>90%。

綜上所述，實驗所建立網果酸模HPLC指紋圖譜可為網果酸模質量控制提供科學依據。