基于網絡藥理學探索丹參飲治療慢性萎縮性胃炎的機制研究

李昆陽 劉華一

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是以胃黏膜固有腺體萎縮、減少為主的一類疾病，甚至發展為伴腸上皮化生和(或)異型增生的癌前病變。CAG屬Correa級聯反應的中央階段，對于疾病的發展和轉歸具有重要的承接作用，積極治療對胃癌的防治具有重要臨床意義。然而，目前西醫尚未有統一、規范、有效的治療方案，多采用抗炎、殺菌、抑酸、助消化、黏膜保護等方法緩解癥狀，對于萎縮病理狀態的改變仍缺乏特效藥，僅通過具有生物活性功能的維生素、葉酸及微量元素改善胃黏膜狀態，以求延緩其進展。中醫方劑具有“多成分、多靶點、多途徑”的特點在治療該疾病中具有巨大優勢，不僅能夠明顯改善癥狀，及時阻斷病程發展[1-3]，甚至能夠逆轉萎縮[4]。究其癥狀，CAG類屬中醫“胃痞”范疇，病程纏綿，“久病必虛，久病必瘀”且“陽明為多氣多血之腑”，“氣虛血瘀”貫穿CAG的整個疾病過程，故在補脾、疏肝、消積、理氣辨證治療基礎上加以活血、行氣、祛瘀之法。

丹參飲載于《時方歌括》，由丹參、檀香、砂仁組成，“治心痛、胃脘諸痛多效”，為行氣活血的代表方劑。方中重用丹參一兩為君，取其“專入血分，活血行血，內達臟腑而化瘀滯”之功；檀、砂各用一錢為佐，檀香調脾胃、利胸膈，為理氣之要藥；砂仁理元氣、通滯氣，醒脾養胃；三藥合用，行氣活血而瘀自散，為行氣化瘀止痛之良方。現代藥理研究表明，丹參飲具有抗菌、抗炎、鎮痛等多種作用，臨床上廣泛應用于CAG、消化性潰瘍等多種脾胃病的治療中，能夠有效改善氣虛血瘀癥狀[5-7]。但目前對其作用于疾病的活性物質和特定的分子機制知之甚少，值得進一步深入探究。

網絡藥理學是一種涵蓋化學信息學、生物信息學、網絡生物學和傳統藥理學的新方法，可更系統地揭示中藥的活性成分和潛在機制，從整體探索中藥和機體的相互作用[8]。本研究采用網絡藥理學的方法，探究丹參飲治療CAG的有效成分、作用靶點及潛在機制，為后續深入研究提供參考和依據。

1 材料和方法

1.1 丹參飲化學成分的收集、篩選和靶點預測

通過檢索TCMSP[9]獲得丹參、檀香、砂仁已知的全部化學成分，以口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18為條件，篩選出丹參飲的主要活性成分；通過PubChem獲得活性成分的SMILES；檢索Swiss Target Prediction[10]，獲得相關靶點信息；與TCMSP獲得成分靶點合并去重，即可獲得丹參飲主要活性成分的相關靶點。

1.2 CAG靶點檢索

本研究以“Gastritis、Atrophic”為關鍵詞分別檢索DrugBank、DisGeNET、Genetic Association Database(GAD)和Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)數據庫，去除假陽性后合并去重，即為CAG相關靶點。

1.3 網絡構建及分析

通過UniProt數據庫將所有靶點進行標準化處理，得到其官方名稱及UniProt ID，用于后續分析工作。將丹參飲活性成分相關靶點與CAG相關靶點相映射，可獲得丹參飲治療CAG的潛在作用靶點。根據上述靶點預測結果，采用Cytoscape3.2.1軟件構建丹參飲“活性成分-作用靶點”關系網絡，其中節點(node)代表活性成分、靶點；邊(edge)連接活性成分與靶點，展現兩者之間的關系。

1.4 富集分析

本研究利用 DAVID(Version 6.8)平臺對共同靶點進行Gene ontology(GO)注釋分析和Pathway分析，用于描述候選靶點特征; 運用Omicshare云平臺將結果可視化。其中GO注釋包括生物過程(biological process，BP)、細胞成分(cell component，CC)和分子功能(molecular functions，MF)，KEGG通路分析結果以氣泡圖形勢呈現富集結果的通路，以探究丹參飲治療CAG可能的作用機制。

1.5 蛋白質相互作用網絡的構建

蛋白質通常與脂質、核酸和其他蛋白質等共同發揮作用，蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡有助于了解各種蛋白質在復雜疾病中的作用，運用Cytoscape軟件中Bisogenet插件構建網絡并將結果可視化。分別構建丹參飲活性成分相關靶點及CAG相關靶點PPI網絡；Merge獲取2個網絡的交集，即為丹參飲治療CAG的直接或間接靶點調控網絡。

1.6 核心靶點篩選及聚類分析

網絡中的每個節點均有自由度(degree centrality，DC)、中心中介性(betweenness centrality，BC)、緊密度(closeness centrality，CC)、特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)、網絡中心性(network centrality，NC)和局部邊連通性(loal average connectivity，LAC)等參數信息，可通過network analyzer、CytNCA插件進行網絡分析評估。先以“DC≥2中位數DC”為篩選條件，然后選擇BC、CC、DC、EC、LAC、NC均大于中位數的節點為核心靶點。

人類機體復雜，由多個相對獨立而又相互作用的功能模塊組成，聚類分析作為一種重要的分類方法可以清楚展現PPI網絡中的固有規律，MCODE算法生成的模塊穩定可靠，將篩選出的核心靶點以K-core≥4為條件篩選出聚類較好的基因模塊，從多角度解釋丹參飲治療CAG的機理。

2 結果

2.1 丹參飲活性成分

通過TCMSP數據庫收集到437個丹參飲成分，篩選后得到78個主要活性成分；另納入12種上述三種藥物中含量較高的成分，剔除不含相關信息的化學成分后，最終確定丹參飲86個活性成分，其中丹參67個、檀香7個、砂仁14個，丹參與檀香、丹參與砂仁各有一個共同活性成分，具體成分信息見表1。

表1 丹參飲中潛在活性成分表

續表

續表

2.2 丹參飲作用靶點

檢索、去重后共得到丹參飲有效靶點355個，其中丹參304個、砂仁147個、檀香123個，三味藥共同作用靶點57個，占全部藥物的16.1%，丹參、檀香共同靶點25個(7%)，丹參、砂仁共同靶點51個(14.4%)，砂仁、檀香共同靶點4個(1.1%)，可見不同藥物可通過相同的作用靶點共同發揮作用。degree值代表與該節點相連的邊的條數，越大則表明在網絡中越關鍵，圖中節點顏色隨著degree值的變大而逐漸加深，可直觀看出相對主要活性成分和重要靶點(圖1)。

2.3 丹參飲治療CAG的潛在作用靶點

檢索DrugBank、DisGeNET、GAD、OMIM分別得到14個、118個、46個和15個CAG相關靶點，去除重復后共得到165個CAG相關靶點。與丹參飲主要成分的作用靶點相映射，構建“丹參飲-作用靶點-CAG”網絡，139條邊連接99個節點(圖2)，75個丹參飲成分通過作用于24個靶點對CAG起到直接治療作用，其中62個成分作用于PTGS2,29個成分作用于PPARG，NR1H2、DRD2、EGFR、TNF等靶點也被多個成分所調節，木犀草素、丹參酮IIA、丹參新醌D、β-谷甾醇、Glimepiride等活性成分調節多個靶點，由此可見中藥治療疾病多成分、多靶點的特點。

2.4 丹參飲治療CAG的生物功能分析

為了深入了解丹參飲對CAG的藥理作用機制，對24個共同靶點(PTGS2、PPARG、NR1H2、DRD2、EGFR、TNF、CYP1A2、BCL2、CYP2C19、TP53、ABCB1、AKT1、CYP2B6、CYP2C8、CYP2E1、CYP3A4、GSTP1、HSPA2、IL2、IL6、MIF、ODC1、SOD1、VEGFA)進行了GO和KEGG通路分析，得到235個GO注釋結果和56條通路。其中16個BP、10個CC、8個MF具有重要意義(圖3)，其生物功能主要與物質代謝、細胞增殖與凋亡、信號轉導、氧化還原等相關，這體現出丹參飲通過調控多個復雜的生物過程來治療CAG。 以P<0.05為條件，共得到48條重要通路(圖4)，其中多與代謝、癌癥、炎癥相關，排名在前10的通路依次為：藥物代謝細胞P450、化學致癌、亞油酸代謝、癌癥通路、花生四烯酸代謝、細胞色素P450介導的異生素代謝、HIF-1信號通路、肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、PI3K-Akt信號通路、麻疹。

2.5 PPI網絡的關鍵節點

為了全面探究丹參飲治療CAG的核心藥理機制，課題組采用拓撲方法評估核心網絡，共得到關鍵節點156個，篩選策略示意圖見圖5。

2.6 聚類分析

將上述156個關鍵靶點，運用MCODE 插件進行聚類分析，得到5個聚類較好的模塊，然后對各個模塊進行富集分析，GO結果所涉及的生物過程依次為：物質代謝，基因表達、沉默和復制，DNA、RNA損傷修復和轉錄調控，蛋白質合成，細胞凋亡的負調控。KEGG通路共37條，多與癌癥相關，不同模塊富集到相同的通路有核糖體、細胞周期、泛素介導的蛋白質降解、PI3K-Akt信號通路、前列腺癌、病毒致癌、癌癥通路。

注：A為丹參的“成分—靶點”網絡；B為砂仁的“成分—靶點”網絡；C為檀香的“成分—靶點”網絡；D為三味藥“成分—靶點”的韋恩圖。菱形—成分、圓形—靶點、藍色—丹參、黃色—砂仁、綠色—檀香。

注：菱形—成分、圓形—靶點、藍色—丹參、黃色—砂仁、綠色—檀香。

圖3 丹參飲活性成分治療CAG潛在靶點的GO生物學過程

圖4 丹參飲活性成分治療CAG潛在靶點的KEGG通路分析結果示意圖

圖5 丹參飲治療CAG的PPI網絡關鍵節點篩選示意圖

3 討論

本研究篩選出丹參飲86個活性成分、355個潛在靶點，與165個CAG靶點相映射，得到24個共同靶點，包括多種功能酶、信號分子、轉錄因子等物質；富集分析得到生物功能235個、信號通路56條，發現丹參飲的75個有效成分主要通過調控PTGS2、PPARG、NR1H2、DRD2、EGFR、TNF等相關靶點蛋白，干預機體的氧化還原、物質代謝、炎癥反應、細胞增殖凋亡等生物途徑，并可能通過缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)、PI3K-Akt等信號通路來治療CAG，并抑制其發展為胃癌。

CAG作為一個臨床復雜疾病，為更全面探討其機理，本研究又構建了PPI網絡并進行拓撲分析，將拓撲得到的156個關鍵靶點進行聚類分析，得到5個模塊，并對這5個模塊進行富集分析。結果顯示，GO生物過程除了之前得出的物質代謝、細胞增殖凋亡外，還增加了基因表達、沉默和復制，DNA、RNA損傷修復和轉錄調控，以及蛋白質合成。KEGG通路仍主要富集在癌癥及與癌癥發生發展密切相關的細胞周期、泛素介導的蛋白質降解、PI3K-Akt等信號通路上。

CAG萎縮分布不均勻，胃黏膜同時存在多種病理狀態，其發生發展是一個多階段、多因素、受多基因作用的復雜過程，而丹參飲可從多層次、多角度參與到胃黏膜的組織修復，這與其他研究結果所顯示的丹參飲能夠提高機體抗氧化能力，減輕細胞壞死及凋亡，改善胃黏膜微環境缺血缺氧狀態等作用也具有一致性[11-12]。丹參飲通過調節多個生物過程來治療CAG，與中醫通過辨證論治，治病求本，調節“體質”的觀點也不謀而合。

本研究發現丹參飲治療CAG的作用機制主要體現在控制炎癥反應和調節細胞的增殖和凋亡。(1)核心靶點均與炎癥反應及細胞的增殖和凋亡密切相關。其中PTGS2催化花生四烯酸產生多種炎性前列腺素，介導機體炎癥反應，并與細胞粘附增加、表型變化、細胞凋亡和腫瘤血管生成密切相關[13-14]；PPARG是脂肪代謝和葡萄糖穩態的關鍵調節因子，能調節MAPK p38、IL-6的磷酸化，其活化能促進細胞凋亡、抑制細胞遷移和增殖，并抑制NF-κB介導的促炎反應[15-16]；核受體NR1H2可監測內源性甾醇水平以維持全身膽固醇水平，并調節炎癥反應，并能夠抑制細胞增殖[17-18]；多巴胺受體DRD2參與自主運動、情緒及激素調節、多巴胺誘導的免疫效應和腫瘤等眾多生物過程，并與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移、自噬、凋亡都密切相關[19-20]；受體酪氨酸激酶EGFR編碼表皮生長因子受體，通過其多種配體結合促發關鍵細胞磷酸化，激活至少4個下游信號級聯，包括RAS/RAF/MEK/ERK、PI3K/AKT、PLCγ/PKC、STATs，也可以激活NF-κB信號級聯反應，還可直接磷酸化其他蛋白質、酶及受體，導致細胞增殖、遷移和分化[21-23]；TNF主要由活化的巨噬細胞產生，可誘導某些腫瘤細胞系的細胞死亡，在特定條件下可以刺激細胞增殖并誘導細胞分化，是重要的炎癥介質，并參與某些自身免疫病的病理損傷[24-26]。(2)富集分析結果中多種生物過程和通路都與炎癥反應及細胞的增殖和凋亡密切相關。除了各種疾病通路外，顯著富集于HIF-1、PI3K/Akt、TNF、MAPK、VEGF等通路上。缺氧是腫瘤微環境中驅動腫瘤發生的最常見原因之一，HIF-1對維持氧穩態起主要調節作用，其過表達與STAT3、NF-κB、TLR4、Myc、mTOR、AP-1、IGF-1、Wnt、TGF-β、Notch1等的激活都密切相關，進而影響炎癥反應、血管生成、細胞增殖凋亡、遷移和侵襲、物質代謝而在腫瘤進程中發揮重要作用[27-28]。PI3K-Akt信號通路經常在各種人類癌癥中被激活，PI3K催化PIP3的產生，PIP3作為第二個信使激活Akt，活化的AKT通過磷酸化多種酶、激酶和轉錄因子等下游因子，進而調節細胞的功能；PI3K/Akt/NF-κB/BMP-2-Smad軸、PTEN/PI3K/Akt軸、PI3K/Akt-mTOR等多種途徑均可調節全身炎癥反應，腫瘤細胞的增殖與凋亡、侵襲轉移、存活和自噬[29-30]。機體內各種反應錯綜復雜，通路之間互相關聯影響，丹參飲通過調節多個靶點和通路，共同發揮抗炎和抗氧化作用，進而調節細胞的增殖和凋亡。而CAG作為一種慢性炎癥，或(已)發展為胃癌前病變，抑制炎癥反應及細胞的增殖和凋亡對防止該病轉變為胃癌具有重要意義。

中醫藥符合現代精準醫學中個體化治療的理念，但在分子生物學水平上證明其治療效果仍然是一個巨大的挑戰。“多成分、多靶點”既是中醫藥的優勢，同時也為基礎研究帶來了不便，網絡藥理學通過整合各數據庫結果，建立“藥物—成分—靶點—疾病”關系預測模型，系統而整體地去探究藥物治療疾病的作用關系，符合中醫的整體觀念，有利于中醫藥的現代研究和臨床推廣。但是，該方法仍具有一些缺陷，目前現有的中醫藥相關數據庫存在積累不足、質量不高、現有數據重復性不強的局限性，而中醫藥成分信息的正確性對于網絡構建與分析結果至關重要；另外該方法僅是通過計算機模擬得到活性成分與相關靶基因，但不能明確活性成分對靶基因調控關系，仍需進一步通過實驗研究加以驗證。

綜上，本研究通過網絡藥理學初步闡明丹參飲治療CAG的作用機制，科學地體現出了中醫整體觀和系統性，為中醫藥多成分、多靶點、多途徑的治療優勢提供了有力證據，為中醫藥治療多因素導致的復雜疾病提供了新途徑，同時為后續分子機制研究提供了一定方向。