西紅花苷生物合成途徑研究進(jìn)展

蘇玉秀，李軍，高廣春(通訊作者)

（1.嘉興學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興；2.嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)學(xué)院，浙江 嘉興）

0 引言

西紅花（學(xué)名：Crocus sativusL.），是一種鳶尾科番紅花屬的多年生花卉，又稱藏紅花、番紅花。西紅花原生于亞洲西南部，最早由希臘人人工栽培。主要分布在歐洲、地中海及中亞等地，在我國已有悠久的栽培使用史，在《本草綱目》中已有記載。其藥用部位為柱頭，75,000朵花才可收集0.45公斤（1磅）番紅花柱頭，因而在我國作為名貴的中藥材使用。

其味甘性平，能活血化瘀，散郁開結(jié)，止痛，用于治療憂思郁結(jié)，胸膈痞悶，傷寒發(fā)狂，驚怖恍惚等。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，西紅花的眾多藥理學(xué)作用也得到研究，如對血液系統(tǒng)的作用：抗血凝作用。能延長血漿凝血酶原及活化部分凝血活酶時(shí)間（aPTT），抑制ADP和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集，加速尿激酶及纖維蛋白溶酶的纖溶作用；對子宮的作用：對子宮有興奮作用，引起子宮節(jié)律性收縮，提高緊張性與興奮性，大劑量時(shí)出現(xiàn)痙攣性收縮，對已受孕子宮則更為敏感。其子宮興奮作用可被乙磺酸麥角毒堿部分阻斷，阿托品對其無影響；對循環(huán)系統(tǒng)的作用：有降低血壓，興奮呼吸系統(tǒng)作用，對心血管系統(tǒng)的作用與其中含多量的鉀鹽有關(guān)。亦有報(bào)道，西紅花的花被、雄蕊及其花粉可以不同程度的擴(kuò)張離體冠狀血管。西紅花在臨床上更多被用于治療心血管疾病及脂肪肝等疾病。

西紅花的主要活性成分為以西紅花酸及其糖苷衍生物類胡蘿卜素類化合物，包括：西紅花苷、西紅花酸、藏花醛、藏紅花苦素[1]。其中西紅花苷已被藥典規(guī)定作為評價(jià)西紅花品質(zhì)的主要活性指標(biāo)，因而對于西紅花苷的研究，尤其是對于西紅花苷的生物合成途徑研究，正在吸引著眾多研究人員（圖1、圖2）。

圖1 關(guān)于西紅花苷研究，歷年所發(fā)表文獻(xiàn)—來源于中國知網(wǎng)

圖2 西紅花苷研究相關(guān)文獻(xiàn)主題分布圖—來源于中國知網(wǎng)

1 西紅花苷的結(jié)構(gòu)

脫輔基類胡蘿卜素化合物西紅花苷，是西紅花的主要活性成分。純凈的西紅花苷為紅色晶體，易溶于水成透明黃色溶液，可溶于乙醇和丙二醇，不溶于油脂。化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易分解，色調(diào)幾乎不受pH值的影響，在酸性介質(zhì)和堿性介質(zhì)中都比β-胡蘿卜素穩(wěn)定，堿性時(shí)黃色更鮮明。最大吸收波長為440nm。耐鹽性、耐還原性、耐微生物性均好，耐熱、耐光性在酸性時(shí)差，耐金屬離子（除鐵以外，遇鐵變黑）好。染著于淀粉和蛋白質(zhì)時(shí)較穩(wěn)定，在水溶液中不夠穩(wěn)定（圖3）。

圖3 西紅花苷化學(xué)結(jié)構(gòu)

2 生物合成途徑

西紅花中類胡蘿卜素類化合物的合成途徑可分為兩類，以西紅花苷合成中的重要前體物質(zhì)玉米黃質(zhì)[2]為界，可分為上游途徑、下游途徑其中下游途徑為西紅花苷合成的特殊途徑[3]。

目前研究證明，此條途徑是以玉米黃質(zhì)為起始物，在類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（CCD）[4]的催化下，氧化裂解生成西紅花二醛和β-環(huán)檸檬醛[5]，之后產(chǎn)物將經(jīng)過UDP- 葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 （UGT）和醛脫氫酶（ALDH）的催化，得到藏紅花苦素、西紅花苷、西紅花酸等脫輔基類胡蘿卜素化合物[6]。（圖4）

圖4 西紅花苷等類胡蘿卜素類化合物合成途徑[24]

3 生物合成途徑的關(guān)鍵酶

目前對于西紅花苷類胡蘿卜素類化合物的生物合成途徑研究，眾多研究者將關(guān)注點(diǎn)集中于相關(guān)的酶基因家族的研究[7]。常見的酶基因家族包括：β-LCY、BCH、CCD、NCEDs、UGtase等[8]，西紅花苷類胡蘿卜素化合物的代謝水平受這些酶基因家族的調(diào)控，甚至?xí)绊懼兴幬骷t花的品質(zhì)。

3.1 BCH酶基因家族

β-胡蘿卜素水解酶BCH酶基因家族由2-3個基因座組成[9]，每個基因都具有四個及四個以上的可側(cè)接保守外顯子的內(nèi)含子，這種結(jié)構(gòu)有利于發(fā)展可直接測序的通用引物[10]。在西紅花中，主要有兩種BCH基因高度表達(dá)，分別是BCH1和BCH2，基因長度分別為1461bp和891bp。在成熟的西紅花柱頭中，BCH1的表達(dá)程度更高。BCH1不僅僅只分布在西紅花中，在番茄、柑橘中也有表達(dá)。在西紅花苷類胡蘿卜素類化合物的生物合成途徑中，BCH酶所催化的反應(yīng)是關(guān)鍵的限速步驟[11]。BCH 在西紅花柱頭中，通過催化 β-胡蘿卜素發(fā)生 β 環(huán)羥基化反應(yīng)，生成玉米黃質(zhì)[12]。

3.2 CCD酶基因家族

類胡蘿卜素裂解雙加氧酶CCD家族可分為五個亞家族：CCD1、CCD4、CCD7、CCD8及 NCEDs。所有的CCD酶結(jié)構(gòu)相似，由Fe2+原子和β- 螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)組成，7個螺旋結(jié)構(gòu)被不保守圓頂所覆蓋[13]。

但是CCD基因家族中不同種類酶的內(nèi)含子數(shù)目有較大不同，CCD1、CCD4、CCD7、CCD8四個亞家族的內(nèi)含子數(shù)目分別是：10個以上、1-2個、5-6個、4-5個。通過對多種高等植物的CCD基因家族進(jìn)行測定篩選。發(fā)現(xiàn)在不同的雙子葉植物和單子葉植物中，同一亞家族的不同CCD酶基因結(jié)構(gòu)也不同，只有幾組同工酶結(jié)構(gòu)相近。其中CCD1、CCD4、CCD7、CCD8基因亞家族在催化作用中的位點(diǎn)、底物，甚至于產(chǎn)物都有巨大區(qū)別。例如某一CCD酶底物具有特異性，而有些CCD酶底物可以催化多種底物。

目前研究證明，CCD2酶在西紅花苷生物合成途徑中起到關(guān)鍵作用，可以裂解前體物質(zhì)玉米黃質(zhì)并起到限速作用。西紅花的柱頭發(fā)育可分為三個階段，分別是黃色時(shí)期、橘色時(shí)期和完全成熟時(shí)期[14]。在西紅花柱頭的橘色時(shí)期，西紅花酸含量最高，而此時(shí)CCD2基因高度表達(dá)。有研究將帶有玉米黃質(zhì)生物合成質(zhì)粒（Kanr）的大腸桿菌菌株與帶有將玉米黃質(zhì)轉(zhuǎn)化為藏花紅素二醛的CsCCD2酶pTHIO-CsCCD2（Cmr）載體共轉(zhuǎn)化,Frusciante等[24]使用anti-6xHis抗體進(jìn)行的免疫印跡分析，證實(shí)了硫氧還原蛋白-CsCCD2和硫氧還原蛋白-ALDH融合蛋白在預(yù)期分子量分別為81.9和69.8至76.9 kD的表達(dá)。進(jìn)一步說明，CCD2在西紅花苷生物合成中起關(guān)鍵作用。

3.3 ALDH酶基因家族

醛脫氫酶基因ALDH，可將醛脫氫氧化生成相應(yīng)的羧酸，家族龐大，廣泛存在于植物動物中，可劃分為24個亞家族，其中有14個亞家族存在于植物中。在西紅花苷生物合成途徑中起催化作用的ALDH[15]，可將西紅花酸二醛催化生成西紅花二酸。陳祥慧等[4]通過對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行整合以及篩選代謝組數(shù)據(jù)，得出三條具有全長）ORF的ALDH序列，采用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行代謝工程研究，進(jìn)一步證實(shí)了ALDH在西紅花苷生物合成中的重要作用，證明了整合組學(xué)數(shù)據(jù)對于篩選合成過程中目標(biāo)基因的優(yōu)越性。

3.4 UGT酶基因家族

UGT-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶,是高等植物糖基化作用的關(guān)鍵酶[16]，芳香化合物等次生代謝產(chǎn)物都存在這種現(xiàn)象。在西紅花柱頭中，類胡蘿卜類化合物常以糖苷形式如西紅花苷存在植物中，而UGT可以催化葡萄糖與受體通過糖苷鍵形式連接[17]，在西紅花苷合成過程中，UGT家族可分為兩個亞型：UGTcs2和UGTcs3,基因長度分別為1383bp和1425bp。UGT可以催化類胡蘿卜素通過糖基化反應(yīng)生成西紅花苷和藏紅花苦苷[18]，將脂溶性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的水溶性物質(zhì)。Moraga[9]等采用克隆技術(shù)，從柱頭中得到兩條含有植物次生代謝產(chǎn)物糖基轉(zhuǎn)移酶（PSPG）結(jié)構(gòu)域的重組蛋白：UGTCs2以及UGTCs3。研究證明，在富含西紅花苷的柱頭中，UGTCs2高表達(dá)，在體外酶實(shí)驗(yàn)中的研究結(jié)果，進(jìn)一步證明了UGTCs2在西紅花苷合成途徑中，起到了重要的催化糖基化作用。

4 結(jié)論與展望

隨著人們對傳統(tǒng)中醫(yī)藥的重視日益增加，對于可用于治療心血管疾病及肝硬化等疾病的名貴中藥材西紅花的研究也日益廣泛。近年來。關(guān)于西紅花研究的文獻(xiàn)發(fā)表逐年增加，而關(guān)于西紅花的生物合成研究，尤其是合成途徑中相關(guān)代謝酶及其基因家族的研究也有上升趨勢。關(guān)于西紅花合成的下游途徑，以玉米黃質(zhì)為起始[19]，可通過BCH、CCD、UCT、ALDH等相關(guān)酶及其龐大的基因家族所調(diào)控、催化，生成西紅花二醛、β-環(huán)檸檬醛[20]，最后得到藏紅花苦素、西紅花苷、西紅花酸等脫輔基類胡蘿卜素類化合物[21]。目前的研究表明，對于CCD酶基因家族的研究已很充分，但對于其他相關(guān)酶的研究還有待研究者繼續(xù)深入探索。

近年來，現(xiàn)代生物技術(shù)水平已有大幅提升，眾多先進(jìn)技術(shù)如PCR技術(shù)已被運(yùn)用到提升西紅花苷產(chǎn)量和品質(zhì)的研究中[22]，通過整合基因組學(xué)數(shù)據(jù)，對目標(biāo)基因進(jìn)行篩選、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制，獲取最優(yōu)調(diào)控基因[23]。現(xiàn)代生物技術(shù)手段結(jié)合計(jì)算機(jī)篩選、數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，提升中藥資源品質(zhì)及產(chǎn)量已成為潮流。D’Agostino[25]等早在2007年就已完成了存在于西紅花柱頭中完整的EST序列，為后續(xù)研究者對西紅花苷合成過程中相關(guān)酶基因的研究提供了助力。對于西紅花苷合成的下游途徑，研究者應(yīng)利用好現(xiàn)代生物技術(shù)先進(jìn)技術(shù)，進(jìn)一步深入研究相關(guān)酶基因家族，提升西紅花品質(zhì)。