芒柄花素介導結腸癌細胞的凋亡作用

劉金星，李星辰，陳玉，盧海燕

（桂林醫學院臨床醫學院，廣西 桂林）

0 引言

結腸癌(Colorectal cancer,CRC)已成為最常見的消化道惡性腫瘤之一, 其發病率和死亡率均居全球前列，并呈上升趨勢, 在我國, 結腸癌死亡率已位于惡性腫瘤死亡率的第五位[1], 嚴重影響人類健康和正常生活,目前國際上針對此結腸癌的治療手段主要以手術為主的綜合治療，但效果不理想，有研究表明結腸癌病人5年生存率為65.1%[2]，仍未達到期望值，并且傳統治療手段花費高，大部分家庭無力負擔。因此，探明藥物介導結腸癌細胞凋亡的分子機制，尋找一種高效低毒的藥物具有重要臨床意義?，F代藥理學研究表明芒柄花素（formononetin)具有良好的抗腫瘤等作用[3]，本實驗擬通過不同濃度的芒柄花素（0、50、75、100μmol /L）分別作用于結腸癌RKO細胞株，觀察結腸癌RKO細胞MMP1、VEGFA、PPP2R2A蛋白水平變化，探討芒柄花素誘導結腸癌細胞的凋亡機制，結果報告如下。

1 主要儀器和試劑

結腸癌RKO細胞(桂林醫學院基礎醫學院實驗室），98%芒柄花素（方西安云悅生物科技有限公司），Eppendorf Centrifuge 5810離 心 機,CDW-86L328超 低溫冰箱，Eppendorf 超凈臺，美國伯樂垂直電泳儀Mini-PROTEA，MMP1、VEGFA、PPP2R2A抗體（碧云天生物科技有 限 公 司），PageRuler prest Protein Ladder，5級 WESTAR SUPERNONV，-20度冰箱，伯樂超靈敏多功能化學發光成像系統ChemiDoc Touch，塞默細胞培養箱。

2 實驗方法

2.1 細胞培養

使用培養液將細胞數調整為（2-5）×109cell/mL，將細胞置于含10% 胎牛血清（購自合肥博美生物公司）和1%青霉素的1640培養基后在含5%CO2的37℃培養箱中常規培養傳代，以上均為無菌操作。

2.2 采用Western blot法檢測RKO細胞蛋白表達

用不同濃度芒柄花素處理RKO細胞48h，提取總蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測樣品蛋白濃度，以 3: 1 體積比與SDS-PAGE上樣緩沖液混合，置于-80度冰箱保存，配制好SDS-PAGE凝膠后上樣，調濃縮膠電泳電壓為80V、1h，分離膠為 120 V、1.5h，電泳完成后轉膜 2h，常規操作后加入 MMP1、VEGFA、PPP2R2A抗體（抗體稀釋度1：500）4 ℃緩慢搖晃孵育過夜，用TBST溶液洗PVDF膜 5 min×3次，羊抗鼠二抗（抗體稀釋度1：400）室溫孵育1h，用TBST溶液洗PVDF膜 5 min×3次，使用化學發光液A、B按1：1的比例混合均勻后，均勻涂抹于PVDF膜上，放置于化學發光儀，使用凝膠分析系統記錄并保存結果。

2.3 統計分析

3 結果

RKO細胞凋亡相關蛋白（MMP1蛋白、VEGFA、PPP2R2A蛋白）的表達情況。Western blot結果顯示，對照組、實驗組50、75、100μmol /L芒柄花素RKO細胞MMP1蛋白表達水平為呈下調趨勢；VEGFA蛋白表達水平為同樣呈下調趨勢，PPP2R2A蛋白表達水平為呈上調趨勢。

芒柄花素對MMP1、VEGFA、PPP2R2A蛋白表達水平的影響（見下圖）Wester blot結果表明，與對照組相比實驗組50、75、100μmol/L芒柄花素RKO細胞蛋白表達分別：MMPI：（1.324±0.034）、（1.219±0.028）、（0.923±0.037）、（0.436±0.029）；（0.639±0.025）、（0.462±0.031）、34）、（0.517±0.022）、（1.218±0.0313）。對照組相比，實驗組MMP1蛋白水平、VEGFA蛋白水平下調，PPP2R2A蛋白水平上調，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖1

4 實驗分析

凋亡是活體內局部組織中單個細胞程序性細胞死亡的表現形式，細胞凋亡機制在細胞的發生發展過程中起著至關重要的作用，一旦細胞凋亡機制失去作用，細胞生長失控就會演變成癌細胞，在當今以手術治療結腸癌為主特別是晚期結腸癌效果不佳的背景下，細胞凋亡機制成為結腸癌基因治療的熱點。芒柄花素存在于豆類植物紅車軸草的花序及帶花枝葉，刺芒柄花全草中，有研究發現芒柄花素對結腸癌[4]、乳腺癌[5]、膀胱癌[6]、鼻咽癌[7]等多種腫瘤細胞的生長均有不同程度的抑制作用。本實驗將不同濃度的芒柄花素作用于RKO細胞，觀察在細胞凋亡機制中的某些蛋白（MMP1、VEGFA、PPP2R2A）的表達情況，進而探討其對結腸癌細胞增殖的介導作用。

間質膠原酶（MMP1）作為MMPs家族的其中一類，能夠降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原，參與機體生理及病理過程，與多種癌變有關，有研究證明，MMP1幾乎在所有類型的癌癥中均能表達，且其高表達往往預示著預后不良[8-10]，王大平等研究發現TIMPs能夠限制骨腫瘤向周圍組織浸潤和侵襲，可能與其抑制MMP1的活性有關。[11]。實體惡性腫瘤的發生發展過程中離不開新血管的生成[8]，結腸癌作為實體惡性腫瘤的一類其發生發展過程自然也離不開血管的供應，研究發現VEGFA過表達能夠有效的刺激新血管的產生[13],某些抗腫瘤藥物可以通過下調VEGFA蛋白水平抑制腫瘤血管的生成從而發揮抗腫瘤效果，姚子涵等研究發現蟾毒靈可通過抑制血管內皮細胞生成，抑制裸鼠人結腸癌移植瘤瘤體的生長，可能與下調VEGFA蛋白水平有關[14]。本實驗Western blot結果顯示MMP1、VEGFA蛋白水平均下調，且成濃度依賴性。

近年來有研究發現PPP2R2A作為細胞凋亡通中的作用靶點與多種惡性腫瘤的發生發展過程有關，Wei Zhao研究發現miR-556-5p通過抑制PPP2R2A的表達參與前列腺癌的發生[15]；Zhang Jing發現miR-614通過靶向PPP2R2A促進卵巢癌細胞增殖[16]；Wen Long Liang發現過表達miR-892a可能通過直接抑制PPP2R2A的表達選擇性的促進結直腸癌細胞的增殖[17]，但藥物對PPP2R2A蛋白的直接調節作用卻鮮有報道。本實驗通過檢測PPP2R2A蛋白表達水平發現，結果呈上調趨勢，推測芒柄花素可能激活了細胞凋亡機制，促進了RKO細胞凋亡

5 實驗結論

綜上，本實驗得出結論：芒柄花素可抑制結腸癌細胞增殖，介導其凋亡，可能與下調MMP1、VEGFA蛋白水平，上調PPP2R2A蛋白水平，激活細胞凋亡機制有關。