余甘子提取物抗氧化能力分析和對(duì)酪氨酸酶活性的影響

于麗娟，吳麗華，王金香，李雪瑞，田 浩，楊 芳，李晚誼，肖 丹，李智敏*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650221；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650205；3.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009)

【研究意義】余甘子(PhyllanthusemblicaL.;P.emblica),又名滇橄欖，為大戟科葉下珠屬落葉喬木或灌木，被世界衛(wèi)生組織列為在世界范圍內(nèi)推廣種植的3種保健植物之一；廣泛分布于中國(guó)、印度、印度尼西亞和馬來西亞等熱帶和亞熱帶地區(qū)，其中云南省是中國(guó)余甘子野生資源的主要分布區(qū)[1]。余甘子果實(shí)富含多種人體有益物質(zhì)，如多酚、黃酮、多糖、維生素、有機(jī)酸等[2]，因此不僅能清熱涼血、消食健胃、生津止咳，同時(shí)還具有抗炎、降脂、降壓、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等多種藥用功效[3]。【前人研究進(jìn)展】多酚和黃酮類化合物是余甘子的主要功效成分，不但與余甘子果實(shí)提取物的抗氧化活性密切相關(guān)，還與其大部分藥理作用如抗病原微生物、抗炎、調(diào)節(jié)免疫，抗衰老等密切相關(guān)[3-4]。從天然植物中提取多酚和黃酮類物質(zhì)，利用其抗氧化、抗衰老等活性，開發(fā)功能性食品和日用品具有廣泛的應(yīng)用前景[5]。【本研究切入點(diǎn)】作為富含多酚和黃酮類物質(zhì)的藥食兩用資源，余甘子極具開發(fā)價(jià)值和市場(chǎng)潛力，但余甘子目前仍存在開發(fā)利用率低、產(chǎn)品附加值不高的問題。【擬解決的關(guān)鍵問題】文章以余甘子果實(shí)為材料，采用水提法和乙醇提法提取其中的有效成分，分析其抗氧化活性分析和對(duì)酪氨酸酶活性的影響，探究余甘子的功效；研究結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了余甘子果實(shí)富含多酚和黃酮類活性物質(zhì)，且水提物優(yōu)于醇提物；同時(shí)明確了余甘子果實(shí)提取物具有極強(qiáng)的抗氧化能力，對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，對(duì)羥自由基的清除能力最弱；而且研究發(fā)現(xiàn)余甘子果實(shí)提取物可影響酪氨酸酶活性，低濃度提取物引起酶活性升高，高濃度則抑制酶活性，但作用機(jī)制比較復(fù)雜有待進(jìn)一步研究。研究結(jié)果可為促進(jìn)余甘子果實(shí)的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

余甘子果實(shí)清洗后去核烘干，研磨成粉末后過篩，得到干粉；L-DOPA(L-多巴)，酪氨酸酶(25KU)，DPPH(1,1-苯基-2-苦肼基自由基)，ABTS(2,2聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)，均從上海源葉生物科技有限公司采購(gòu)；30 % H2O2，過硫酸鉀和水楊酸等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

電子分析天平(梅特勒-托利多，ME204)；電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司，DK-98-Ⅱ)；超聲儀(昆山超聲，KQ5200E)；酶標(biāo)儀(Thermo Scientific，MULTISKAN GO)；離心機(jī)(Eppendorf，5424 R)等。

1.3 方法

1.3.1 余甘子水提物的制備 取余甘子果實(shí)干粉，按料液比1∶8(m/V)加入蒸餾水，沸水回流提取1 h，離心過濾后取上清液，如此重復(fù)提取2次，將2次濾液合并，干燥后得到余甘子水提物。

1.3.2 余甘子醇提物的制備 取余甘子果實(shí)干粉，按料液比1∶8(m/V)加入95 %乙醇，回流提取1 h，離心后取上清液，反復(fù)提取2次后將濾液合并，干燥后得到余甘子醇提物。

1.3.3 供試液制備 余甘子提取物經(jīng)超聲輔助溶解后，稀釋至適當(dāng)濃度用于測(cè)定多酚和黃酮含量，分析其對(duì)DPPH、ABTS+、羥自由基的清除能力和對(duì)酪氨酸酶活性的影響。

1.3.4 多酚含量的測(cè)定 采用福林酚法測(cè)定余甘子果實(shí)提取物中多酚含量[6]。采用沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：橫坐標(biāo)為沒食子酸質(zhì)量濃度(μg/mL)，縱坐標(biāo)為760 nm處吸光值，得回歸方程：y=4.6529x+0.0015(R2=0.9991)。經(jīng)適當(dāng)稀釋后取50 μl樣品，加入200 μl蒸餾水和250 μl福林酚，室溫反應(yīng)8 min；加入20 % Na2CO3750 μl，混勻；加入400 μl 蒸餾水避光反應(yīng)1.5 h，于760 nm處檢測(cè)吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)液中多酚的含量。

1.3.5 黃酮含量的測(cè)定 采用紫外分光光度法測(cè)定黃酮含量。采用蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以蘆丁濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以505 nm處吸光值為縱坐標(biāo)，得回歸方程：y=0.0019x+1.244(R2=0.998)。經(jīng)適當(dāng)稀釋后取2 mL樣品，加入1 mL 5 % 亞硝酸鈉，搖勻、反應(yīng)6 min；再加入10 % 硝酸鋁1 mL，反應(yīng)6 min；加入4 % NaOH 4 mL、80 %乙醇2 mL，定容至10 mL，反應(yīng)15 min，測(cè)505 nm處吸光值。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)液中黃酮的含量。

1.3.6 DPPH清除能力測(cè)定 樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，取100 μl，加入2.0×10-4mol/L DPPH 溶液100 μl，混勻，常溫反應(yīng)1 h后，測(cè)定 517 nm 處吸光值，記為AS；DPPH 溶液在 517 nm 處的吸光值記為A1；各樣品自身在517 nm 處的吸光值記為A0。按公式I(%)=[1-(As-A0)/A1]×100 計(jì)算樣品對(duì)DPPH的清除率。

1.3.7 ABTS+清除能力測(cè)定 利用7 mmol/L ABTS 和 2.45 mmol/L 過硫酸鉀在避光室溫條件下反應(yīng) 12～16 h， 制備ABTS+；用無水乙醇稀釋，測(cè) 734 nm 處吸光值，至吸光值為 0.7±0.05時(shí)備用。

取經(jīng)適當(dāng)稀釋后的樣品50 μl，加入200 μl ABTS+溶液，混勻、室溫避光反應(yīng)6 min后，測(cè)定734 nm處吸光值，記為AS；ABTS+溶液于734 nm 處的吸光值記為A1；各樣品自身于 734 nm 處的吸光值記為A0。按公式I(%)=[1-(As-A0)/A1]×100 計(jì)算樣品對(duì)ABTS+的清除率。

1.3.8 羥自由基清除能力測(cè)定 分別加入 9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L 水楊酸-乙醇和樣品各1 mL后，加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2用于啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃水浴反應(yīng)15 min，測(cè)定反應(yīng)液在510 nm處的吸光值，記為As；同時(shí)測(cè)定各樣品自身于510 nm的吸光值，記為A0；空白溶液于510 nm的吸光度值，記為A1；按公式I(%)=[1-(As-A0)/A1]×100，計(jì)算樣品對(duì)羥自由基的清除率。

1.3.9 酪氨酸酶活性抑制動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 酪氨酸酶活性的檢測(cè)采用酪氨酸酶-多巴速率氧化法。按表1所示，將PBS磷酸鹽緩沖液、稀釋至適當(dāng)濃度的樣品、酪氨酸酶混合均勻；37 ℃孵育10 min后，加入100 μl L-多巴溶液混勻。以PBS緩沖液為對(duì)照，連續(xù)反應(yīng)30min、檢測(cè)溶液在 475 nm 處的吸收值，得到AC1、AC2、AT1和AT2。計(jì)算樣品對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用，計(jì)算公式如下：

表1 酪氨酸酶活性測(cè)定反應(yīng)液

活性抑制率(%)=[1-(AT1-AT2)/(AC1-AC2)]×100

式中，AC1: 不加樣品、加酪氨酸酶的反應(yīng)液的吸光值；AC2:不加樣品、也不加酪氨酸酶的反應(yīng)液的吸光值；AT1: 同時(shí)添加樣品、酪氨酸酶的反應(yīng)液的吸光度；AT2: 加樣品、但不加酪氨酸酶的反應(yīng)液的吸光值。

1.3.10 生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有測(cè)試均重復(fù)3次，以平均值±平均偏差的方式表達(dá)結(jié)果；同時(shí)采用 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 余甘子提取物中多酚和黃酮含量的檢測(cè)

多酚和黃酮類物質(zhì)都含有酚羥基，可溶于水、乙醇等溶劑中[7]。因此用水或乙醇為溶劑從植物中提取多酚和黃酮類物質(zhì)是常用方法。本實(shí)驗(yàn)分別以水和乙醇為溶劑從余甘子果實(shí)中提取多酚和黃酮。如表2所示，以水為溶劑從余甘子果實(shí)中提取多酚含量可達(dá)到22.95 mg/g DW，而以乙醇為溶劑可提取多酚為15.61 mg/g DW，水提法得到的余甘子多酚含量是醇提法的1.47倍。采用水提法提取黃酮類物質(zhì)含量為34.61 mg/g DW，醇提物中的含量是17.61 mg/g DW，水提物得到的黃酮是醇提法的1.96倍。以水為溶劑提取的多酚和黃酮含量均高于乙醇，推測(cè)余甘子中水溶性多酚和黃酮含量高于醇溶性多酚和黃酮。

表2 余甘子提取物中多酚和黃酮類化合物的含量

2.2 余甘子提取物對(duì)3種自由基的清除率

多酚和黃酮類物質(zhì)均具有抗氧化活性，可清除機(jī)體中的自由基，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，提高機(jī)體的抗衰老能力[8-10]。本實(shí)驗(yàn)采用水提法和醇提法從余甘子果實(shí)中提取多酚和黃酮類物質(zhì)，并對(duì)其自由基清除能力進(jìn)行了分析。結(jié)果(表3)表明，無論是水提物還是醇提物對(duì)3種自由基都表現(xiàn)出極強(qiáng)的清除能力，其中余甘子水提物和醇提物清除DPPH的IC50值分別為4.58和5.62 μg/mL；余甘子水提物和醇提物清除ABTS+的IC50值分別為9.61和14.29 μg/mL；水提物和醇提物清除羥自由基的IC50值分別為1.99和5.02 mg/mL。水提物對(duì)3種自由基的清除能力高于醇提物；并且提取物對(duì)3種自由基清除能力大小依次是DPPH>ABTS+>羥自由基，對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，對(duì)羥自由基的清除能力最弱。

表3 余甘子提取物對(duì)DPPH、ABTS+、羥自由基的清除能力

2.3 相關(guān)性分析

同時(shí)本文分析了余甘子果肉提取物中多酚、黃酮類化合物含量與其自由基清除能力的相關(guān)性。如表4所示，多酚、黃酮類化合物含量均與其DPPHIC50值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)性在-0.80以上；與ABTS+和羥自由基IC50值均表現(xiàn)出極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)性在-0.95以上。表明多酚類和黃酮類化合物是余甘子清除DPPH、ABTS+和羥自由基的主要功效成分，這為證實(shí)余甘子果肉富含多酚和黃酮類化合物，具有較強(qiáng)抗氧化能力，可進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

表4 多酚、黃酮含量與余甘子抗氧化活性的相關(guān)性分析

2.4 余甘子提取物對(duì)酪氨酸酶活性的影響

余甘子果實(shí)提取物對(duì)酪氨酸酶活性影響的體外實(shí)驗(yàn)(圖1)表明，不添加任何提取物時(shí)(對(duì)照組)，酪氨酸酶活性表現(xiàn)為：初期，酶活性迅速呈指數(shù)級(jí)上升，10 min后酶活性趨于平穩(wěn)不發(fā)生明顯變化；當(dāng)在反應(yīng)體系中加入余甘子提取物時(shí)，與對(duì)照相比酪氨酸酶活性發(fā)生改變，其中加入0.2 mg/mL提取物(低濃度組)，酪氨酸酶活性在10 min內(nèi)與對(duì)照組接近，沒有顯著變化，但隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)酶活性持續(xù)升高，在反應(yīng)時(shí)間達(dá)30 min時(shí)高于對(duì)照；當(dāng)濃度為0.6 mg/mL時(shí)(中濃度組)，在反應(yīng)15 min之內(nèi)對(duì)酪氨酸酶一直表現(xiàn)出抑制作用，之后抑制作用逐漸減弱，反應(yīng)20 min之后酶活性逐漸超過對(duì)照組；當(dāng)加入1.8 mg/mL(高濃度組)水提物時(shí)，在整個(gè)觀察期間酪氨酸酶活性內(nèi)一直被抑制，只是隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)抑制效應(yīng)逐漸減弱。余甘子醇提物對(duì)酪氨酸酶活性的影響與水提物相似，即：低濃度的醇提物有激活酪氨酸酶的作用，中濃度組表現(xiàn)出先抑制后激活的規(guī)律，高濃度組對(duì)酪氨酸酶表現(xiàn)出抑制作用。分析反應(yīng)15 min時(shí)水提物和醇提物對(duì)酪氨酸酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)雖然由于重復(fù)之間變化較大，二者差異不顯著，但與醇提物相比，水提物對(duì)酪氨酸酶活性表現(xiàn)出更明顯的激活或抑制作用。

A：不同濃度水提物對(duì)酪氨酸酶活性的影響；B：不同濃度醇提物對(duì)酪氨酸酶活性的影響；C：余甘子水提物和醇提物對(duì)酪氨酸酶活性抑制率的比較A: The enzymatic reaction curve added with different concentration of aqueous extracts; B: The enzymatic reaction curve added with different concentration of ethanolic extracts; C: Comparison of the inhibition rate of aqueous and ethanolic extracts

3 討 論

3.1 余甘子果實(shí)水提物和醇提物中多酚和黃酮類物質(zhì)的含量

本文分別采用水提和醇提法提取余甘子果實(shí)中的有效成分，檢測(cè)其中多酚和黃酮含量，進(jìn)一步確認(rèn)余甘子果實(shí)中存在豐富的多酚和黃酮類化合物；但由于提取溶劑不同，導(dǎo)致提取物中多酚和黃酮含量不同，其中水提物中多酚和黃酮類化合物均高于醇提物，水提得到余甘子果實(shí)中多酚和黃酮類含量分別為22.95、34.61mg/g DW，是醇提的1.47，1.96倍。根據(jù)多酚和黃酮類物質(zhì)富含羥基的特性和相似相溶原理，采用水或極性溶劑(如乙醇和丙酮)對(duì)其進(jìn)行提取，當(dāng)提取溶劑的極性與余甘子中酚類和黃酮化合物極性相近時(shí)，才能更充分高效地提取活性物質(zhì)[7]。本實(shí)驗(yàn)分別以水和95%乙醇為溶劑用煮沸回流1 h、抽提2次的方法從余甘子果實(shí)中抽提活性物質(zhì)，干燥后分別得到水提物和醇提物，水提法得到的活性物質(zhì)更多，抽提率更高。

3.2 余甘子果實(shí)水提物和醇提物的抗氧化活性

脂質(zhì)過氧化是導(dǎo)致細(xì)胞衰老的主要原因。自由基(羥自由基、超氧自由基、羧自由基、一氧化氮等)能加速體內(nèi)不飽和脂肪酸氧化為類脂過氧化物，加快器官的衰老[11]。凡能減少此類自由基的產(chǎn)生或積累，即可抑制氧化反應(yīng)的發(fā)生，起到防衰老、防疾病等作用。DPPH是一種以氮為中心的自由基，樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力，可以反映其抗氧化能力[12-13]；ABTS法也是檢測(cè)體外抗氧化能力的常用方法之一[14]。筆者對(duì)2種方法提取得到的余甘子果實(shí)樣品分別進(jìn)行了DPPH、ABTS+和羥基自由基清除能力分析。IC50值越低，表明抗氧化能力越強(qiáng)[15]。結(jié)果表明，水提物和醇提物對(duì)3種自由基均有很強(qiáng)的清除作用，其中水提物清除DPPH、ABTS+和羥自由基的IC50的濃度分別為4.58、9.61、1.99 mg/mL。研究結(jié)果與楊冰鑫(2019)[16]報(bào)道的余甘子多酚對(duì)DPPH自由基(EC50為 9 μg/mL)、羥自由基(EC50為 0.47 mg/mL)[12]的清除能力趨勢(shì)一致。且本研究中水提物的抗氧化能力高于醇提物，這與水提物中多酚和黃酮含量高于醇提物的結(jié)果一致。而且本文進(jìn)一步分析了余甘子果實(shí)提取物中多酚和黃酮類化合物含量與其清除自由基能力的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)多酚和黃酮，都與余甘子提取物清除DPPH、ABTS+、羥自由基的IC50值呈顯著負(fù)相關(guān)，表明多酚和黃酮這兩類物質(zhì)是清除以上3種自由基的主要成分。但余甘子果實(shí)中的多酚和黃酮化合物種類多樣、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，抗氧化能力不盡相同。推測(cè)當(dāng)用2種提取試劑抽提多酚和黃酮類活性成分的時(shí)候，不僅含量不同，而且多酚和黃酮的組成結(jié)構(gòu)也差異巨大，因而最終表現(xiàn)出不同的抗氧化能力。后期可進(jìn)一步對(duì)余甘子果實(shí)中多酚和黃酮物質(zhì)進(jìn)行深入分離鑒定。

3.3 余甘子果實(shí)水提物和醇提物對(duì)酪氨酸酶活性的影響

酪氨酸酶是引起人體產(chǎn)生黑色素以及果蔬褐變的關(guān)鍵酶，采用酪氨酸酶抑制劑抑制酪氨酸酶活性可一定程度上減少黑色素的生成，因此酪氨酸酶抑制劑在美容、食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[17]。多酚類物質(zhì)可以抑制酪氨酸酶的活性[18]。在本實(shí)驗(yàn)中，余甘子水提物和醇提物對(duì)酪氨酸酶的活性影響表現(xiàn)出濃度效應(yīng)。低濃度對(duì)酪氨酸酶有激活作用，中濃度組表現(xiàn)出先抑制后激活的規(guī)律，高濃度則表現(xiàn)出抑制作用。余甘子醇提物對(duì)酪氨酸酶活性影響與水提物相似，總體趨勢(shì)上醇提物的影響效果弱于水提物。余甘子提取物對(duì)酪氨酸酶活性的作用效應(yīng)可能是人們利用其開發(fā)生毛、防脫發(fā)專利的基礎(chǔ)[19-20]。基于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)余甘子的提取物不但富含多酚和黃酮類物質(zhì)，同時(shí)含有很多其他活性成分，因此較低劑量余甘子提取物可激活酪氨酸酶，發(fā)揮黑發(fā)護(hù)發(fā)功效；較高濃度余甘子提取物則可以用于開發(fā)功能性日化品，發(fā)揮抗氧化、抗衰老作用。

4 結(jié) 論

本研究以余甘子果實(shí)為材料，采用水提法和乙醇提法提取其中的有效成分，從體外抗氧化活性和其對(duì)酪氨酸酶活性的影響，探究余甘子的功效。研究結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了余甘子果實(shí)富含多酚和黃酮類活性物質(zhì)，且水提物優(yōu)于醇提物；同時(shí)明確了余甘子果實(shí)提取物具有極強(qiáng)的抗氧化能力，對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，依次強(qiáng)于ABTS+、羥自由基；研究還發(fā)現(xiàn)余甘子果實(shí)提取物可影響酪氨酸酶活性，低濃度提取物引起酶活性升高，高濃度則抑制酶活性，作用機(jī)制比較復(fù)雜有待進(jìn)一步分析。本研究結(jié)果可為促進(jìn)余甘子果實(shí)的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。