云南煙草根際土壤真菌群落演替特征

李正風，鐘 莉，朱 杰，唐 麗，吳 濤，廖頭根，夏玉珍，楊利擎

(1.云南中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心,云南 昆明 650231；2.紅云紅河(集團)有限責任公司,云南 彌勒 652300;3.紅塔煙草(集團)有限責任公司，云南 玉溪 653100；4.北京微普聯(lián)合生物科技有限公司，北京 102200)

【研究意義】土壤是優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)系統(tǒng)工程的基礎(chǔ)，是影響煙葉質(zhì)量的重要環(huán)境因素[1]。不同質(zhì)地土壤的理化性狀有顯著差異，土壤機械組成、通透性、水分、溫度和養(yǎng)分狀況與煙葉生長發(fā)育和風格特色有著密切關(guān)系[2]。在煙葉種植過程中，植煙土壤由于長期使用化肥，導致土層板結(jié)，肥力下降，土壤微生物多樣性減少，將嚴重影響煙葉品質(zhì)[3-5]。如符菁等研究表明土壤施用復合微生物菌肥、光合菌劑均能提高土壤的酶活性[6]。所以，植煙土壤改良已受到煙草科研工作者們的高度關(guān)注。【前人研究進展】目前，通過改良植煙土壤來提高煙葉產(chǎn)量及品質(zhì)的研究主要集中在耕作方式、土壤改良劑添加、不同肥料施用等對土壤肥力的改變方面 ，而有關(guān)煙草生產(chǎn)各階段的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化以及土壤理化參數(shù)、肥力效果與微生物群落結(jié)構(gòu)間的動態(tài)變化機制等還未進行系統(tǒng)深入研究?！颈狙芯壳腥朦c】傳統(tǒng)的真菌分類鑒定主要是以真菌的形態(tài)、生長以及生理生化等特征為依據(jù)。然而真菌的種類繁多，個體多態(tài)性不明顯，個體的生長、生理生化特征也會隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定。因此，采用傳統(tǒng)的方法對真菌進行正確的分類存在較大的困難。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer,ITS)高通量測序已被廣泛的應用于真菌分類鑒定中[7-9]。ITS包含ITS1和ITS2兩種，ITS1位于真核生物核糖體rDNA序列的18S和5.8S之間，ITS2位于真核生物核糖體rDNA序列5.8S和28S之間，屬于中度保守的區(qū)域，利用它可將真菌歸類到種或亞種水平。而利用IonS5TMXL測序平臺對ITS1或ITS2區(qū)進行單端測序，具有更長的讀長、利于鑒定低豐度群落物種，且費用低，是研究真菌群落多樣性的首選之策。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用高通量測序技術(shù)，對云南7個地區(qū)不同肥力土壤中的真菌群落在煙草生長不同階段的演替特征進行分析，并對土壤理化指標與微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)規(guī)律進行探究，以期為植煙土壤、肥料的選擇以及病害防治提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在云南省7個縣(市)(昆明市宜良縣、玉溪市華寧縣、紅河州彌勒縣、玉溪市新平縣、曲靖市陸良縣、大理州南澗縣、楚雄州楚雄市)，對植煙前(2018年3月)、團棵期(2018年5月)、成熟期(2018年6月)、成熟期(2018年9月)4個階段不同肥力的根際土壤采用“S”形取樣法，在每個采樣區(qū)隨機采集5個不同位點的土壤樣品(表1)，等量混合后作為該單元的代表性樣品。煙葉生長不同時期采集土壤樣品時保持與上一次采樣相同的地點進行。采集0～20 cm深的土壤，用PVC管進行打孔取樣，可以保證每個點的取樣深度和重量保持一致。每個采樣單元采集大約取1 kg左右土樣，如果采集樣品太多，用“四分法”棄去多余土壤，最后用無菌自封袋包裝，于-20 ℃保存，并帶回實驗室進行進一步的分析。

表1 土壤采樣信息

1.2 理化參數(shù)的測定

在煙草不同生長時期(植煙前、團棵期、旺長期、成熟期)均采用多點取樣法采集不同層次的土壤樣品。將所采土壤樣品帶回實驗室后自然風干，室溫保存，用于檢測土壤樣品的理化性質(zhì)(包括土壤酸堿度pH值、電導率EC值、速效氮、速效磷、速效鉀、總碳、總氮、有機碳、有機氮)。其中pH值采用pH計法(水土質(zhì)量比2.5∶1)測定，電導率EC值由EC計測定(水土質(zhì)量比2∶1)，速效氮、速效磷、速效鉀的測定分別采用堿解擴散法、碳酸氫鈉法和醋酸銨法，總碳、總氮、有機碳、有機氮含量用元素分析儀測定。

1.3 DNA提取和高通量測序

采用MP FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒對土壤樣本的基因組DNA進行提取。取適量樣品DNA于離心管中，用無菌水稀釋樣品至1 ng/μl，使用帶Barcode的特異性引物ITS5-1737F(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)和ITS2-2043R(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)進行真菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS,Internal Transcribed Spacer)PCR擴增。擴增得到的PCR產(chǎn)物利用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后將PCR產(chǎn)物送至諾禾致源生物信息科技有限公司，利用Thermo Fisher Scientific的Ion S5 XL進行單端測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

使用Cutadapt軟件[10]過濾和按Barcode拆分樣本后，通過UCHIME與物種注釋數(shù)據(jù)庫進行比對檢測嵌合體序列，并去除其中的嵌合體序列，得到有效數(shù)據(jù)。利用Uparse方法進行OTU(Operational Taxonomic Units)聚類[11]，對每個OTU代表序列做物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況。

1.5 統(tǒng)計分析

對標準化后的樣本相對豐度和物種數(shù)進行計算。為進一步探究分組樣品間的群落結(jié)構(gòu)差異，使用ANOSIM分析方法對分組樣品的物種組成和群落結(jié)構(gòu)進行差異顯著性檢驗，通過NMDS降維圖展示群落結(jié)構(gòu)差異，并選用LEfSe算法計算各組中差異類群的LDA分值，對差異最顯著的類群(LDA分值大于4)進行研究。使用RDA分析探索群落組成與環(huán)境因子之間的關(guān)系，并由向前選擇(Forward Selection)得到顯著影響群落變化的環(huán)境影響因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 植煙前后土壤理化指標的變化

由表2可見，植煙前土壤的pH值多在4.5～5.5，團棵期較植煙前的pH值有所升高，達到煙草生長最適范圍(pH5.5～6.5)，pH值的變化與肥料的施用有一定關(guān)系。土壤電導率呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(表2)。云南植煙土壤速效氮含量處于豐富水平，除新平土壤速效氮水平在適宜烤煙生產(chǎn)范圍(45～135 mg/kg)內(nèi)，其他地區(qū)都偏高。各地區(qū)速效磷分布不均，玉溪、陸良、昆明3地較適宜烤煙生產(chǎn)范圍(10～35 mg/kg)偏高，其他地區(qū)都在適宜的范圍內(nèi)。多數(shù)地區(qū)速效鉀含量高于適宜烤煙生產(chǎn)范圍(120～200 mg/kg)，只有新平、玉溪兩地在適宜范圍內(nèi)。楚雄和南澗土壤中的總碳、總氮、有機碳、有機氮含量都較其他地區(qū)高。

表2 各階段土壤理化指標

2.2 植煙前后土壤真菌群落組成的變化

植煙前(3月)，土壤真菌群落相對豐度高的科是叢赤殼科(Nectriaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、Plectosphaerellaceae科、麥角菌科(Clavicipitaceae)、曲霉科(Aspergillaceae)(圖1-A)。植煙前土壤中，相對豐度高的真菌屬是鐮刀菌屬(Fusarium)、枝孢屬(Cladosporium)、青霉菌屬(Penicillium)、小不整球殼屬(Plectosphaerella)、被孢霉屬(Mortierella)等(圖1-B)。

A為豐度最高的10個科；B為豐度最高的10個屬。下同A is the 10 families with the highest abundance; B is the 10 genera with the highest abundance.The same as below

團棵期(5月)土壤真菌群落，相對豐度高的是叢赤殼科(Nectriaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、白蘑科(Tricholomataceae)、曲霉科(Aspergillaceae)等(圖2-A)，相對豐度高的屬是鐮刀菌屬(Fusarium)、香蘑屬(Lepista)、被孢霉屬(Mortierella)、鏈格孢屬(Alternaria)等(圖2-B)。

圖2 團棵期土壤真菌優(yōu)勢類群Fig.2 The most abundant fungal taxa in the soil during rosette stage

旺長期(6月)，土壤真菌群落相對豐度高的科是叢赤殼科(Nectriaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、Trimorphomycetaceae科、毛殼菌科(Chaetomiaceae)等(圖3-A)，相對豐度高的屬是鐮刀菌屬(Fusarium)和Saitozyma屬等(圖3-B)。

圖3 旺長期土壤真菌優(yōu)勢類群Fig.3 The most abundant fungal taxa in the soil during vigorous growing stage

成熟期(9月)，土壤真菌群落相對豐度高的科是叢赤殼科(Nectriaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、毛殼菌科(Chaetomiaceae)、Trimorphomycetaceae科、暗球腔菌科(Phaeosphaeriaceae)等(圖4-A)，相對豐度高的屬是鐮刀菌屬(Fusarium)、Saitozyma屬、Setophoma屬、被孢霉屬(Mortierella)、錐蓋傘屬(Conocybe)等(圖4-B)。

圖4 成熟期土壤真菌優(yōu)勢類群Fig.4 The most abundant fungal taxa in the soil during mature stage

對植煙前及植煙后煙葉生長的3個階段土壤真菌群落組成進行了比較分析，4個階段土壤中真菌群落組成具有顯著差異(表3)，其中植煙前與植煙后3個階段土壤真菌群落組成的差異最為顯著，旺長期與成熟期植煙土壤真菌群落組成差異最小(圖5,表3)。

表3 不同階段土壤真菌群落組成差異的ANOSIM分析結(jié)果

圖5 不同階段土壤樣品中真菌群落MDS圖Fig.5 MDS plot of fungal communities in the soil in different stages

LDA分析顯示，植煙前，隸屬于座囊菌綱(Dothideomycetes)、煤炱目(Capnodiales)、枝孢霉屬(Cladosporium)的致病菌Cladosporiumchasmanthicola和小叢殼目(Glomerellales)、Plectosphaerellaceae科、小不整球殼屬(Plectosphaerella)的Plectosphaerellacucumerina豐度顯著高于植煙后的各個階段(圖6-A)。在植煙后的團棵期，植煙土壤中白蘑科(Tricholomataceae)、香蘑屬(Lepista)的花臉香蘑(Lepistasordida)和格孢腔菌科(Pleosporaceae)的鏈格孢屬(Alternaria)具有顯著優(yōu)勢(圖6-A、B)，但花臉香蘑(Lepistasordida)僅在昆明低肥力土壤中大量出現(xiàn)。在旺長期土壤中叢赤殼科(Nectriaceae)的鐮刀菌屬(Fusarium)具有顯著優(yōu)勢(圖6-A、B)。到了成熟期，糞銹傘科(Bolbitiaceae)、錐蓋傘屬(Conocybe)的大孢錐蓋傘(Conocybemacrospora)以及叢赤殼科(Nectriaceae)、鐮刀菌屬(Fusarium)的尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)相比于其他3個階段具有顯著優(yōu)勢(圖6-A、B)，大孢錐蓋傘(Conocybemacrospora)僅在楚雄中等肥力土壤中大量出現(xiàn)。

不同階段不同地區(qū)土壤中的真菌物種數(shù)通過比較顯示，昆明土壤中的物種數(shù)較高，新平土壤中的物種數(shù)較低(圖7)。

A：植煙前；B：團棵期；C：旺長期；D：成熟期。KM:昆明；YX:玉溪；CX:楚雄；LL:陸良；ML:彌勒；NJ:南澗；XP:新平A: Pre-planting stage; B: Rosette stage; C: Vigorous growing stage; D: Mature stage.KM:Kunming; YX:Yuxi; CX:Chuxiong; LL:Luliang; ML:Mile; NJ:Nanjian; XP:Xinping

2.3 真菌群落與理化指標的相關(guān)性分析

通過RDA分析的向前選擇確定土壤真菌群落的差異主要與土壤速效磷(AP)、有機氮(ON)含量以及土壤墑情(SM)有關(guān)。從不同階段土壤真菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系來看，植煙前和團棵期土壤中的有機氮和速效磷含量較高，土壤墑情較低，到了旺長期和成熟期，土壤有機氮和速效磷含量有所下降，土壤墑情有所升高，這顯著影響了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)(圖8)。

圖8 土壤真菌群落與環(huán)境因子的RDA分析圖Fig.8 RDA plot analysis of the relationship between the fungal communities in the soil and environmental factors

3 討 論

土壤真菌群落的差異主要與土壤中的速效磷、有機氮含量以及土壤墑情有關(guān)。從不同階段來看，植煙前和團棵期土壤有機氮含量較高，到了旺長期和成熟期有所下降；土壤速效磷在旺長期最高，成熟期最低。土壤有機氮含量的變化趨勢主要與土壤施肥的時間有關(guān)，而土壤速效磷含量在旺長期升高很可能與土壤中解磷菌的作用有關(guān)。土壤墑情在旺長期和成熟期明顯高于植煙前和團棵期，這與降水量有很大關(guān)系，云南省降水量一般在6-8月達全年最大。

各地區(qū)的土壤中優(yōu)勢真菌類群有所不同，但是病害菌——鐮刀菌屬(Fusarium)在各地區(qū)都是豐度最高的屬。鐮刀菌是一類世界性分布的真菌，可引起植物的根腐、莖腐、莖基腐、花腐和穗腐等多種病害，能侵染寄主植物維管束系統(tǒng)，破壞植物的輸導組織維管束，并在生長發(fā)育代謝過程中產(chǎn)生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影響產(chǎn)量和品質(zhì)，是生產(chǎn)上防治最艱難的重要病害之一[12]。研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌屬在各地煙草根際土壤中的相對豐度與土壤肥力沒有明顯的相關(guān)性，高肥力和低肥力地區(qū)土壤中均有豐度較高的情況，但各地土壤中在煙草旺長期該屬的豐度是最高的，因此煙葉旺長期是防治這類病害的最重要時期。

在不同階段，土壤中的真菌群落組成以及主要病害種類均發(fā)生明顯的變化。枝孢屬(Cladosporium)的Cladosporiumchasmanthicola在植煙前土壤中的豐度顯著高于植煙后的各階段，如昆明、楚雄、陸良植煙前的土壤中。Plectosphaerellacucumerina的豐度也高于植煙后各階段，如彌勒煙區(qū)該類群豐度均較高。Plectosphaerellacucumerina可侵染黃瓜、甜瓜、番茄、煙草等多種經(jīng)濟作物，導致果實、根、莖部的腐爛[13-14]。因此對該種病害要做好預防工作。在植煙后的團棵期，植煙土壤中的花臉香蘑(Lepistasordida)和鏈格孢屬(Alternaria)為優(yōu)勢類群，其中花臉香蘑(Lepistasordida)僅在昆明低肥力土壤中大量出現(xiàn)，鏈格孢屬(Alternaria)在團棵期玉溪高肥力土壤、南澗低肥力土壤以及新平中等肥力土壤中豐度較高。鏈格孢屬(Alternaria)真菌具有發(fā)生種類較多，寄主范圍較廣，適應性較強等特點，大多數(shù)種類兼性寄生于植物上，引起多種經(jīng)濟植物病害。如Alternariaalternata可使煙草產(chǎn)生赤星病，是煙葉成熟期易發(fā)生的葉斑病，在云南赤星病發(fā)生面積達4萬km2左右，對煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量造成較大影響。在云南煙葉旺長期煙草根際土中篩到一株Alternariaalternata真菌，這種真菌在云南植煙土壤中有較高的豐度，要加以重點防治。對赤星病可通過合理施肥、肥水調(diào)均、保持株間通風透光等措施預防和減輕其危害煙葉。在成熟期大孢錐蓋傘(Conocybemacrospora)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)是優(yōu)勢類群，大孢錐蓋傘(Conocybemacrospora)僅在楚雄煙葉成熟期的中等肥力土壤中大量出現(xiàn)，在煙葉成熟期昆明、玉溪、楚雄土壤中尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)豐度較高。尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)是煙草根腐病的致病菌，煙葉獲取營養(yǎng)物質(zhì)的源頭和通道是煙草的根莖部分，而根莖病害的發(fā)生會嚴重影響煙草品質(zhì)和產(chǎn)量，單一方法很難達到好的防治效果，要根據(jù)植煙地情況，科學協(xié)調(diào)農(nóng)業(yè)防治、化學防治和生物防治措施，才能取得經(jīng)濟、有效的防治效果[15]。

在玉溪植煙前和團棵期的低肥力土壤和楚雄植煙前、團棵期和旺長期的低肥力土壤中青霉菌屬(Penicillium)真菌都有較高的豐度，主要有草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)等，研究表明草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)菌株能夠依靠自身的代謝產(chǎn)物溶解土壤中的難溶無機磷，在磷素的轉(zhuǎn)化中起著非常重要的作用[16-17]。在煙葉團棵期，新平、玉溪2地高肥力土壤中有大量的被孢霉屬(Mortierella)真菌，是土壤中的腐生性真菌，主要分布在植物根面上，對植物不具有致病性，其豐度隨植物的生長逐漸上升，在植物營養(yǎng)生長高峰期活性最強，對纖維素、半纖維素、果膠物質(zhì)等起分解作用，但也有研究表明被孢霉屬(Mortierella)在染黑脛病的煙草根際土中豐度上升[18]。青霉菌屬(Penicillium)、被孢霉屬(Mortierella)與木霉屬(Trichoderma)、毛霉屬(Mucor)同為在植物根系上生長的常見生態(tài)類群，這些真菌可通過產(chǎn)生抗生素、營養(yǎng)競爭、誘導植物產(chǎn)生抗性等方式來防治病害或抑制病原，對維持健康的植煙土壤環(huán)境有重要作用。

4 結(jié) 論

本研究分析了云南7個地區(qū)植煙地不同肥力土壤，煙株生長的4個階段真菌群落動態(tài)及土壤理化指標與微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系。通過研究顯示，不同時期土壤真菌群落組成有顯著變化，植煙前與植煙后各階段的差異最為顯著，真菌群落的演替與土壤速效磷、有機氮、墑情等密切相關(guān)。植煙土壤中真菌種類昆明土壤始終較高，而新平土壤始終較低。在不同階段，Alternaria屬、鐮刀菌屬(Fusarium)、Plectosphaerellacucumerina、Cladosporiumchasmanthicola、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)等的豐度具其優(yōu)勢真菌類群有顯著差異。該項研究結(jié)果可為煙草種植土壤、肥料的選擇以及病害防治提供借鑒。