龍眼DlbZIP21基因克隆與表達(dá)分析

王金英，張樹偉，丁 峰，2*，潘介春*，彭宏祥，范志毅，趙德征，黃 幸，李 琳，王 穎，李浩然

(1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院/廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007；3.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，廣西 南寧 530007；4.廣西宏華生物實(shí)業(yè)股份有限公司，廣西 柳州 545000)

【研究意義】龍眼(DimocarpuslonganLour.)屬無患子科(Sapindaceae)龍眼屬植物，是一種重要的亞熱帶常綠果樹，因其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高及口感美味而具有很高的商業(yè)價(jià)值。在龍眼生長(zhǎng)發(fā)育過程中，花芽分化受多種不良環(huán)境因素的影響，致使成花率降低，進(jìn)而影響龍眼的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。此外，生產(chǎn)上種植的中熟龍眼品種較多，早、晚熟品種較少，品種結(jié)構(gòu)不合理，龍眼收獲期較集中，致使龍眼果實(shí)售價(jià)偏低，也直接影響果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益。堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子可直接參與植物的成花調(diào)控，如bZIP轉(zhuǎn)錄因子FLOWERINGLOCUSD(FD)可與成花關(guān)鍵基因FLOWERINGLOCUST(FT)互作調(diào)控下游基因APETALA1(AP1)和LEAFY(LFY)的表達(dá)從而促進(jìn)植物成花[1]。石硤龍眼一年只能開花結(jié)果一次，而四季蜜龍眼具有一年多次開花結(jié)果特性，但目前關(guān)于bZIP轉(zhuǎn)錄因子參與龍眼成花的調(diào)控機(jī)制尚不明確。因此，分析bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因DlbZIP21在石硤和四季蜜兩個(gè)龍眼品種不同組織和年周期表達(dá)水平的差異性，對(duì)揭示不同龍眼品種成花差異的分子調(diào)控機(jī)制及龍眼的熟期育種和產(chǎn)期調(diào)節(jié)具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】DlbZIP21基因?yàn)閎ZIP轉(zhuǎn)錄因子基因家族中的一員，具有bZIP轉(zhuǎn)錄因子的部分性質(zhì)。bZIP轉(zhuǎn)錄因子在真核生物中廣泛分布且相對(duì)保守[2]，由一個(gè)堿性區(qū)域和一個(gè)bZIP結(jié)構(gòu)構(gòu)成，約包含20個(gè)氨基酸殘基，堿性區(qū)域相對(duì)保守，能通過固定的核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)N-(X)7-R/K與DNA順式原件特異性結(jié)合[3]。目前，已在多種植物中發(fā)現(xiàn)bZIP轉(zhuǎn)錄因子[2，4]，如擬南芥、高梁、蓖麻、玉米和大豆。根據(jù)bZIP堿性結(jié)構(gòu)域及其他保守結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)，可將擬南芥中的bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員分為A、B、C、D、E、F、G、H、I和S共10個(gè)亞家族[3]，不同亞族分別行使不同的功能[5]，目前許多植物bZIP亞族的分類仍以此分類方法為依據(jù)。bZIP轉(zhuǎn)錄因子可參與植物組織分化、細(xì)胞延伸、能量代謝和蛋白調(diào)控等生物學(xué)進(jìn)程。bZIP53蛋白能與啟動(dòng)子中的G-box元件特異性結(jié)合，同時(shí)與bZIP10或bZIP25相互作用，顯著增強(qiáng)與DNA的結(jié)合活性，增加靶基因的轉(zhuǎn)錄水平[6]。OsbZIP39能通過蛋白水解轉(zhuǎn)化為可溶性蛋白，從而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，OsbZIP39DC能激活水稻原生質(zhì)體結(jié)合蛋白1(BiP1)的啟動(dòng)子，并參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[7]，缺乏SC-uORF 59-先導(dǎo)區(qū)的轉(zhuǎn)基因tbz17煙草植株葉片增厚，細(xì)胞增大，蔗糖含量升高[8]。Silveira等[9]研究發(fā)現(xiàn)，AtbZIP9轉(zhuǎn)基因植物能使葉片出現(xiàn)發(fā)育缺陷，誘導(dǎo)其不正常發(fā)育。細(xì)胞分裂素(CTK)和茉莉酸(JA)能提高ATbZIP2基因的轉(zhuǎn)錄水平，增強(qiáng)其表達(dá)量[10]。此外，bZIP 轉(zhuǎn)錄因子能響應(yīng)逆境脅迫，在脅迫條件下植物內(nèi)源脫落酸合成量增加，從而激活bZIP家族基因表達(dá)[2]。在滲透脅迫處理下，MdbZIP48轉(zhuǎn)基因擬南芥株系種子的發(fā)芽率、子葉綠化率和根長(zhǎng)均優(yōu)于野生型擬南芥[11]。Lee等[10]研究發(fā)現(xiàn)，鹽處理能提高ATbZIP53基因的轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)量；AtbZIP2和AtbZIP11基因?qū)Ψ巧锩{迫和激素也有不同響應(yīng)。【本研究切入點(diǎn)】bZIP轉(zhuǎn)錄因子參與擬南芥等植物的成花調(diào)控，推測(cè)DlbZIP21基因可能參與龍眼成花調(diào)控，但目前關(guān)于bZIP轉(zhuǎn)錄因子對(duì)龍眼成花影響的研究未見報(bào)道。【擬解決發(fā)關(guān)鍵問題】對(duì)從石硤和四季蜜龍眼品種中克隆得到的bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因DlbZIP21進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過熒光定量PCR檢測(cè)其在兩個(gè)龍眼品種不同組織和年周期中的特異性表達(dá)情況，揭示不同龍眼品種成花差異的分子調(diào)控機(jī)制，為龍眼的熟期育種和產(chǎn)期調(diào)節(jié)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2019年3月分別在廣西大學(xué)龍眼試驗(yàn)園和果樹標(biāo)本園采集一年只開花一次的石硤龍眼和一年四季開花的四季蜜龍眼的根、莖、葉片、葉柄和花芽，在2019年5月分別采取轉(zhuǎn)色期果皮、果肉和種子等不同組織材料，于2019年1-12月每月分別采集一次石硤和四季蜜龍眼葉片作為年周期材料。各材料洗凈后放入采樣袋中，液氮速凍后帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用TIANGEN多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取龍眼總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA鏈合成，采用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase和ExTaq?進(jìn)行基因克隆PCR檢測(cè)，采用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒進(jìn)行膠回收，采用TB GreenTMPremix ExTaqTMII試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2 DlbZIP21基因克隆

采用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的龍眼各組織總RNA純度，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDN鏈合成。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過3代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并結(jié)合龍眼基因組數(shù)據(jù)獲得的bZIP基因序列，使用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)DlbZIP21特異性引物(表1)，第一階段用高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25.00 μl：PrimeSTAR Max Premix 12.50 μl，ddH2O 9.50 μl，cDNA模板及上、下游引物各1.00 μl。擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性3 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用ExTaq酶進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系25.00 μl：ExTaq0.15 μl，10×ExTaqBuffer 2.50 μl，dNTP Mixture 2.00 μl，模板及上、下游引物各1.00 μl，ddH2O 17.35 μl。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性4 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)純化后克隆到pMD18-T載體進(jìn)行測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用NCBI在線分析DlbZIP21的開放閱讀框(ORF)，同時(shí)獲得不同物種的bZIP氨基酸序列，應(yīng)用BIOXM 2.6推測(cè)DlbZIP21氨基酸序列，使用ExPASy ProtParam在線工具分析DlbZIP21蛋白的理化性質(zhì)，其跨膜螺旋區(qū)使用TMHMM進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用SignalP 4.1 Server在線進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，使用NCBI-CDD對(duì)DlbZIP21蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，應(yīng)用PSORT II Prediction在線預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位，使用NetPhos 3.1 Server分析DlbZIP21蛋白的磷酸化位點(diǎn)，利用在線分析工具SOPMA對(duì)DlbZIP21蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，用DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)，利用MEGA 6.0以鄰近相接法(Neighbour-joining)步長(zhǎng)值1000構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.4 DlbZIP21基因表達(dá)分析

采用LightCycler 480 System熒光定量PCR系統(tǒng)，在96孔板中進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。選用龍眼Actin作內(nèi)參基因，根據(jù)測(cè)序所得的DlbZIP21基因序列設(shè)計(jì)定量引物(表1)，分別以石硤和四季蜜龍眼的根、莖、葉片、葉柄、花芽、果皮、果肉、種子及全年12個(gè)月的葉片cDNA為模板，采用兩步法進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20.00 μl：TB Green Premix ExTaqII 10.00 μl，上、下游引物各0.50 μl，cDNA模板1.00 μl，ddH2O 8.00 μl。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；95 ℃融解5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 0 s，50 ℃降溫30 s。采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[12]，采用Excel 2010進(jìn)行基因表達(dá)水平分析及制圖。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 龍眼總RNA提取及DlbZIP21基因克隆

1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，使用總RNA提取試劑盒提取的龍眼組織RNA無降解且純度較高(圖1-A)，可用于后續(xù)試驗(yàn)；根據(jù)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的基因?yàn)?353 bp，電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物獲得一條清晰明亮、與目的基因大小一致的條帶(圖1-B)，符合后續(xù)試驗(yàn)要求，純化后連接到pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過篩選克隆測(cè)序，獲得龍眼DlbZIP21基因序列信息。

2.2 DlbZIP21基因編碼蛋白的理化性質(zhì)

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，DlbZIP21-sx和DlbZIP21-sj基因的ORF均為1353 bp，各編碼450個(gè)氨基酸殘基；預(yù)測(cè)龍眼蛋白分子式分別為C2143H3433N647O695S13和C2144H3435N647O695S13，分子量分別為49.80和49.81 kD，等電點(diǎn)均為6.53；脂溶指數(shù)均為77.02，不穩(wěn)定系數(shù)分別為62.44和62.71，屬于不穩(wěn)定蛋白；親水指數(shù)分別為-0.544和-0.543，屬于疏水蛋白；帶正電殘基總數(shù)(Arg+Lys)均為49，帶負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)均為51；用在線分析工具PSORT II Prediction預(yù)測(cè)DlbZIP21均定位于細(xì)胞核；SignalP 4.1 Server在線預(yù)測(cè)DlbZIP21蛋白均無信號(hào)肽，利用TMHMM在線預(yù)測(cè)DlbZIP21蛋白均無跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)。由此推測(cè)DlbZIP21蛋白合成后不經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)，在細(xì)胞核中行使催化功能。

2.3 DlbZIP21蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果

以NCBI-CDS對(duì)2個(gè)DlbZIP21蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，結(jié)果(圖2)表明，兩個(gè)DlbZIP21蛋白保守結(jié)構(gòu)域相同，均屬于bZIP蛋白超家族[13]，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育功能，該結(jié)構(gòu)包括1個(gè) bZIP-HBP-1b結(jié)構(gòu)和1個(gè)DOG1結(jié)構(gòu)域，DOG1結(jié)構(gòu)域是一種特殊的植物種子休眠調(diào)節(jié)劑，具有bZIP家族典型結(jié)構(gòu)特征。

M：Marker DL2000；1：石硤；2：四季蜜M：Marker DL2000；1：Shixia；2：Sijimi

圖2 DlbZIP21編碼蛋白的保守功能域Fig.3 Conserved domain of the protein encoded by the DlbZIP21

2.4 DlbZIP21蛋白磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果

蛋白磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果(圖3)顯示，DlbZIP21-sx和DlbZIP21-sj蛋白均含有絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸3種氨基酸磷酸化位點(diǎn)，其中，絲氨酸磷酸化位點(diǎn)分別為45和44個(gè)，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)分別為14和15個(gè)，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)均為2個(gè)；可能是潛在磷酸化位點(diǎn)的為第27位氨基酸，其閾值均為0.995；兩個(gè)蛋白中絲氨酸的磷酸化位點(diǎn)最多。

A：DlbZIP21-sx磷酸位點(diǎn)預(yù)測(cè)；B：DlbZIP21-sj磷酸位點(diǎn)預(yù)測(cè)A：Phosphorylation site prediction of DlbZIP21-sx；B：Phosphorylation site prediction of DlbZIP21-sj

2.5 同源氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果

氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果(圖4)表明，DlbZIP21-sx和DlbZIP21-sj蛋白的氨基酸序列與白羽扁豆(Lupinusalbus，KAE9602904.1)和大豆(Glycinemax，ABI34658.1)蛋白的氨基酸序列具有較高的一致性，相似性為72.69 %。

圖4 DlbZIP21與其他物種bZIP的氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果Fig.4 Sequence alignments of amino acid sequence of DlbZIP21 compared with other species

2.6 DlbZIP21蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果

通過NCBI對(duì)DlbZIP21-sx和DlbZIP21-sj蛋白的氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)(圖5)，獲得以下屬于bZIP基因家族的成員，分別為連蕊茶(Camelliafraterna，QCQ29284.1)、茶樹(Camelliasinensis，AGO05995.1)、可可豆(Theobromacacao，EOY04829.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana，NP_173381.1)、菜豆(Phaseolusvulgaris，AAK39130.1)、大豆(Glycine max，ABI34658.1)、水稻(OryzasativajaponicaGroup，ABA96884.1)、中華獼猴桃(Actinidiachinensisvar.chinensis，PSS29131.1)、土瓶草(Cephalotusfollicularis，GAV61199.1)、澳洲棉(Gossypiumaustrale，KAA3453989.1)、白羽扁豆(Lupinusalbus，KAE9602904.1)、糙葉山黃麻(Parasponiaandersonii，PON35707.1)、甜杏仁(Prunusdulcis，BBG96166.1)和榆樹(Tremaorientale，PON58161.1)。進(jìn)一步利用MEGA 6.0構(gòu)建bZIP21蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果表明DlbZIP21-sx與DlbZIP21-sj蛋白的親緣關(guān)系最近，同時(shí)與大豆、水稻和菜豆的親緣關(guān)系較近，但與擬南芥的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖5 基于bZIP21氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree analysis based on bZIP21 amino acid sequences homology

2.7 DlbZIP21基因表達(dá)水平分析結(jié)果

為了探討DlbZIP21基因在石硤和四季蜜兩個(gè)龍眼品種不同組織和年周期表達(dá)水平的差異性，分別采集兩個(gè)龍眼品種的根、莖、葉片、葉柄、花芽、果皮、果肉和種子進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。從圖6可看出，在四季蜜龍眼各組織中均檢測(cè)到DlbZIP21基因表達(dá)，其中在花芽中的相對(duì)表達(dá)量最高，在葉柄、莖和葉片中的相對(duì)表達(dá)量次之；同時(shí)，DlbZIP21基因在全年均有表達(dá)，其中在成花階段相對(duì)表達(dá)量較高，在果實(shí)發(fā)育期相對(duì)表達(dá)量較低。在石硤龍眼中，檢測(cè)到DlbZIP21基因在葉片中相對(duì)表達(dá)量最高，在莖和花芽中的相對(duì)表達(dá)量次之；同時(shí)DlbZIP21基因在全年均有表達(dá)，其中在成花階段相對(duì)表達(dá)量較高，在果實(shí)發(fā)育階段相對(duì)表達(dá)量較低。

從圖6還可看出，在不同組織中，DlbZIP21基因在2個(gè)龍眼品種的果皮和果肉中表達(dá)量均偏低，在四季蜜龍眼花芽中的表達(dá)量較在石硤龍眼花芽表達(dá)量高5倍；在年周期中，從1-12月DlbZIP21基因在兩個(gè)利用品種中的表達(dá)量總體上呈先上升后下降再上升的變化趨勢(shì)，在四季蜜龍眼中的表達(dá)量普遍高于石硤龍眼，其中在花芽分化期和成花期(12月至翌年4月)的表達(dá)量高于石硤龍眼6～8倍；在果實(shí)采收后(8-10月)DlbZIP21基因在四季蜜龍眼中的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，說明DlbZIP21基因在四季蜜龍眼成花方面發(fā)揮了重要作用，且可能參與誘導(dǎo)四季蜜龍眼一年多次成花。

圖6 DlbZIP21基因在石硤和四季蜜龍眼中的不同表達(dá)水平分析結(jié)果Fig.6 Analysis results of different expression levels ofDlbZIP21 in Shixia and Sijimi

3 討 論

植物bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因家族參與植物成花調(diào)控已被學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)可。通過多年調(diào)查發(fā)現(xiàn)石硤龍眼一年只能開花結(jié)果一次，而四季蜜龍眼可一年多次開花結(jié)果，故克隆石硤和四季蜜龍眼品種的關(guān)鍵基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析及表達(dá)分析，旨在揭示龍眼的成花分子機(jī)制。已有研究表明，bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因家族中的FD基因在植物花期開始前表達(dá)于莖尖分生組織(SAM)中，但不能單獨(dú)誘導(dǎo)開花，F(xiàn)D基因與FT基因互作對(duì)FD基因促進(jìn)成花具有重要作用[1，14]。此外，在光周期作用下可誘導(dǎo)FT基因轉(zhuǎn)運(yùn)到SAM，F(xiàn)T基因與FD基因互作，最終形成具有轉(zhuǎn)錄活性的FD-FT復(fù)合物，上調(diào)下游基因SOC1、AP1和LFY而促進(jìn)成花[15]。目前，關(guān)于龍眼bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因家族參與成花的研究相對(duì)較少，本研究克隆石硤和四季蜜龍眼DlbZIP21基因并分析其在龍眼不同組織和年周期的表達(dá)量，可為挖掘龍眼關(guān)鍵成花基因打下基礎(chǔ)。

DlbZIP21基因?qū)儆赽ZIP轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員，本研究克隆的DlbZIP21基因在石硤和四季蜜龍眼中的ORF均為1353 bp，編碼450個(gè)氨基酸，兩個(gè)品種具有相同的保守結(jié)構(gòu)域；通過系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，DlbZIP21基因與大豆、水稻和菜豆的親緣關(guān)系較近，但與擬南芥的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明DlbZIP21基因與豆科植物功能具有相似性，可為以后研究DlbZIP21基因的功能提供參考；進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，不同植物間的bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因其磷酸化位點(diǎn)也具有較高的一致性，通過對(duì)DlbZIP21蛋白編碼的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，確定其磷酸化位點(diǎn)包括絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸，與曹紅利[16]對(duì)茶樹CsbZIP的分析結(jié)果一致。已有研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，一些AtbZIP基因可調(diào)節(jié)ABRE啟動(dòng)子的順式元件，包括ABF1、ABF2和ABF4，同時(shí)有研究表明，CsbZIP72和CsbZIP76含有bZIP轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子中識(shí)別位點(diǎn)的GCN_Motif順式元件(G-box)[17]，而本研究發(fā)現(xiàn)DlbZIP21蛋白存在一種特殊的植物種子休眠調(diào)節(jié)劑DOG1結(jié)構(gòu)，能參與植物種子發(fā)育，此結(jié)構(gòu)與上述研究結(jié)果相似，均可參與植物生物學(xué)進(jìn)程。

本研究結(jié)果顯示，DlbZIP21基因在四季蜜和石硤龍眼不同組織中均有表達(dá)，其中在四季蜜龍眼花芽中的相對(duì)表達(dá)量高出在石硤龍眼花芽中相對(duì)表達(dá)量的5倍；在年周期中，DlbZIP21基因在兩個(gè)龍眼品種中的相對(duì)表達(dá)量總體上呈先上升后下降再上升的變化趨勢(shì)，但在四季蜜龍眼中的相對(duì)表達(dá)量普遍高于石硤龍眼，在花芽分化期和成花期(12月至翌年4月)，DlbZIP21基因在四季蜜龍眼中的相對(duì)表達(dá)量高于石硤龍眼6～8倍，由于四季蜜龍眼在果實(shí)采收后(8-10月)繼續(xù)開花，同時(shí)DlbZIP21基因在四季蜜龍眼中的相對(duì)表達(dá)量也出現(xiàn)上升趨勢(shì)，而一年開花一次的石硤龍眼相對(duì)表達(dá)量較低且無明顯變化，與四季蜜龍眼具有一年多次開花結(jié)果特性相吻合[18]，但具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

DlbZIP21基因在四季蜜和石硤龍眼不同組織中均有表達(dá)，其中在花芽中的相對(duì)表達(dá)量四季蜜龍眼顯著高于石硤龍眼，在葉片和種子中的相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)為石硤龍眼顯著高于四季蜜龍眼；在年周期中，DlbZIP21基因在四季蜜龍眼中的相對(duì)表達(dá)量普遍高于石硤龍眼，其中在花芽分化期和成花期(12月至翌年4月)的相對(duì)表達(dá)量以四季蜜龍眼顯著高于石硤龍眼，在果實(shí)采收后(8-10月)DlbZIP21基因在四季蜜龍眼中的相對(duì)表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。可見，DlbZIP21基因在誘導(dǎo)龍眼成花方面發(fā)揮重要作用，可能參與誘導(dǎo)四季蜜龍眼一年多次成花。