人重組促紅細胞生成素對大鼠創傷性顱腦損傷后神經細胞凋亡的影響及機制研究

沈 印，葛 劍，李 喆，姚 樂

創傷性顱腦損傷(traumatic brain injury ，TBI)是神經外科的常見疾病，在人類外傷性疾病的發病率中居第二位，具有很高的致死和致殘率[1]。TBI病理過程包括原發性腦損傷和繼發性腦損傷(secondary brain injury,SBI)[2]。

原發性腦損傷是受傷當時由直接機械損傷造成，SBI可在原發腦損傷數小時至數天后發生，包括炎癥反應、細胞鈣離子超載、自由基紊亂、脂質過氧化、線粒體功能障礙、細胞凋亡和彌漫性軸索損傷等[3]。原發性顱腦損傷無法干預，針對SBI，早期正確的臨床干預治療是降低TBI后病死率和致殘率的關鍵。近來研究表明促紅細胞生成素(recombinant human erythropoietin,Rh-EPO) 在TBI后具有神經保護作用。筆者觀察Rh-EPO對大鼠TBI后神經細胞凋亡的影響，探討其發揮神經保護作用的可能機制。

材料與方法

1 實驗材料

1.1實驗動物 健康雄性Wistar大鼠55只，鼠齡21周，體重(220±20)g，由武漢大學人民醫院實驗動物中心提供。SPF(Specefic pathogen Free)級飼養。 動物實驗倫理學批號：SCXK桂.No2014-001。

1.2主要試劑 Rh-EPO(沈陽三生制藥股份公司)；二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒、兔抗鼠Bcl-2 多克隆抗體及鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-peroxidase，SP)試劑盒(武漢博士德公司)。

2 方法

2.1動物分組及模型建立 將55只大鼠隨機數字表法分成假手術組(5只)、 TBI組(25只)及 Rh-EPO組(25只)；TBI組和Rh-EPO組按2、6、24、72、168 h時間點分為5個亞組，各5只。

將大鼠用鹽酸氯胺酮(60mg/kg)腹腔注射麻醉后，其頭部固定于Myneurolab腦立體定向儀上；沿中線切開頭皮，暴露右頂骨，用牙科鉆在冠狀縫后1.5mm、中線旁2.5mm處鉆孔并擴大為5mm×5mm骨窗，保持硬腦膜完整。用美國BenchmarkTM顱腦損傷撞擊器撞擊硬腦膜(速度4m/s，撞擊面直徑2mm，深度2mm，接觸時間1s)，致右頂葉腦挫裂傷；硬膜外置明膠海綿止血，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮，以上均為無菌操作。假手術組除不撞擊外，其他步驟同上。Rh-EPO組于TBI后立即經腹腔注射Rh-EPO 5 000IU/kg，假手術組和TBI組經腹腔注射等劑量0.9%氯化鈉溶液(生理鹽水)。假手術組于術后24h，模型建立后2、6、24、72、168h各組按時間點取標本，過量麻醉后迅速斷頭取腦組織標本。

2.2組織標本檢查 處死大鼠后，取各組大鼠右頂葉相對完整腦皮層組織，用4%多聚甲醛溶液固定24～48h，石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。采用光顯微鏡觀察組織學變化。

2.3免疫組織化學檢測 取各組大鼠右頂葉相對完整腦皮層組織，經4%多聚甲醛溶液固定24～48h后，石蠟包埋、切片。采用SP法檢測假手術組24h、TBI組、Rh-EPO組大鼠所取腦組織Bcl-2表達情況。操作按試劑盒說明進行。在光學顯微鏡下觀察Bcl-2免疫反應的結果，并采用圖像分析軟件進行圖像定量分析，測定各組Bcl-2蛋白陽性細胞數。Bcl-2蛋白主要分布在胞漿內，胞漿/胞膜有棕黃色物質沉積為陽性細胞。每張切片在創傷灶周圍隨機取5個高倍鏡視野(×400)進行分析，Bcl-2用光密度(optical density，OD)值表示。

2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡率 (1)取假手術組右頂葉正常腦組織和其余兩組損傷灶處新鮮腦組織約100mg，用PBS清洗，吸出PBS。用剪刀盡量剪碎腦組織，并用PBS洗1次，吸凈PBS。(2)加入0.4%胰蛋白酶3.0mL，置于37 ℃水浴箱中水浴30min，其間不斷搖晃。并吸凈胰蛋白酶，用PBS洗1次，吸凈PBS。(3)加入PBS 3.0mL，反復吹打1～2min，呈單細胞懸液，用400目篩網過濾，在1 000r/min條件下離心5min，去上清液。(4)加紅細胞裂解液3mL，室溫下振蕩10min，在1 200r/min條件下離心10min，重復2次，去上清液。(5)加Bing buffer液190μL搖勻，加Annexin V 5μL避光染色10min，再加碘化丙啶(propidium iodide，PI)5μL，避光染色5min。應用Epics XL流式細胞儀記錄氬離子激發光波長488nm處紅色熒光，每個樣本計數10 000個細胞，以細胞凋亡的百分率作為檢測指標。

3 統計學分析

結 果

1 各組病理改變

右頂葉打擊區域局部腦挫裂傷，腦組織腫脹，72h為最明顯。400倍光學顯微鏡下，TBI組可見腦組織有明顯的出血壞死灶、血管周圍間隙增寬、神經細胞疏松，可見水腫、大量神經元細胞變性壞死、周圍伴有炎性細胞浸潤(圖1c)。Rh-EPO組各亞組壞死區及周圍水腫區范圍較TBI組縮小，周圍水腫減輕，變性壞死的神經元細胞減少；假手術組組織結構清晰，無腦組織腫脹，未見神經細胞變性壞死(圖1a)。

2 各組Bcl-2水平比較

假手術組可見少量Bcl-2陽性細胞，TBI組2h后Bcl-2陽性細胞表達增多，差異有顯著統計學意義(P<0.01)；24h達高峰，72h出現下降。Rh-EPO組各亞組大鼠皮層可見大量Bcl-2陽性細胞表達，與TBI組比較，Rh-EPO組Bcl-2陽性細胞表達增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 各組大鼠腦組織Bcl-2免疫反應陽性神經元光密度比較

3 各組神經細胞凋亡率比較

假手術組見少量凋亡細胞，TBI組神經細胞凋亡率較假手術組明顯增高(P<0.01)，24h出現高峰。Rh-EPO組神經細胞凋亡率各亞組比TBI組低(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 各組大鼠TBI后神經細胞凋亡率比較個/HP)

討 論

細胞凋亡是細胞接受某種信號后或受到某些因素刺激后一種主動的、由多種基因蛋白相互作用引起的細胞程序性死亡，是一個十分復雜的過程，在這一過程中Bcl-2基因家族起了重要的調控作用[4]。Bcl-2是凋亡抑制基因，可以阻止由鈣離子超載、膜過氧化、自由基損傷等因素引起的神經細胞凋亡，其調控凋亡的機制可能是通過組織細胞色素C和DL-ATP從線粒體向胞質釋放，引發caspase-9激活，抑制細胞凋亡[5-6]。TBI后神經細胞的死亡主要表現為壞死和凋亡兩種形式。細胞凋亡是TBI后神經細胞遲發性死亡的主要機制，它加重了腦組織損傷的程度[7]。因此，抗神經細胞凋亡成為TBI救治研究的新方向。

EPO是一種糖蛋白，相對分子質量約為34 000，血漿中存在的EPO由165個氨基酸組成，主要在腎臟合成，作用于造血系統，是合成紅細胞主要刺激因子。近來研究發現，EPO等造血生長因子不僅參與造血的調控，且對神經系統也具有直接保護作用[8]。EPO及其受體在神經細胞系統內有表達，EPO作為中樞神經系統內源性細胞因子，通過神經元和膠質細胞的旁分泌作用，作用于神經元EPO受體，發揮神經保護和神經營養作用[9]。Rh-EPO 是一種通過基因重組技術合成的糖蛋白，與天然EPO 有著相同氨基酸序列，生物學活性也相似。Rh-EPO也可在任何無損傷的情況下可以透過血腦屏障，通過Rh-EPO受體發揮神經保護作用。大鼠腦室周圍白質損傷模型(periventricular white matterdamage，PWMD)模型中，Rh-EPO促進了腦白質區的血管新生反應[10]。在大鼠腦缺血性實驗模型的研究顯示，Rh-EPO 可通過抗神經細胞凋亡及活化、阻斷興奮性氨基酸神經毒性、阻止一氧化氮生成及減輕炎癥反應等，改善由低氧造成的神經元損傷，發揮神經保護作用[11-12]。在大鼠高氧腦損傷模型中[13]，Rh-EPO 可減少海馬神經元損傷，減輕腦水腫程度。

筆者實驗HE染色發現，顱腦皮層挫裂傷區及其周圍水腫區可見大量凋亡的神經細胞。Rh-EPO組壞死區及周圍水腫區范圍較TBI組縮小，周圍水腫減輕，凋亡細胞減少。Bcl-2免疫組織化學染色結果，TBI組Bcl-2表達明顯較假手術組增高，而Rh-EPO組較TBI組表達增加，同時用流式細胞儀技術檢測神經細胞凋亡率，Rh-EPO組神經細胞凋亡率明顯低于TBI組。

筆者研究表明，Rh-EPO能通過提高Bcl-2表達，減少神經細胞凋亡，具有一定的神經保護作用。Rh-EPO作為一種新型腦保護劑，目前成為研究熱點，也許在不久將來即可應用于臨床治療TBI患者。