卷煙SIROX和滾筒烘絲工序煙絲游離氨基酸的變化

賴燕華，陳翠玲，陶 紅，王 予，汪軍霞，周 瑢

廣東中煙工業有限責任公司技術中心，廣州市荔灣區東沙環翠南路88 號 510385

在卷煙制絲過程中，煙葉原料需經過加溫、加濕、干燥等處理，溫度、濕度等條件的變化會引起煙草化學成分的變化，從而對卷煙的感官品質和內在質量產生影響［1-2］。作為美拉德反應的原料之一，游離氨基酸的變化與工藝參數密切相關。因此，研究煙葉游離氨基酸在制絲工序中的變化，有助于了解煙葉在整個制絲過程中的化學成分變化規律，對提高卷煙產品內在質量和保持其穩定性具有重要意義。

目前，有關煙草制絲過程中游離氨基酸含量變化研究的報道較少。劉江生［3］、賴偉玲［4］運用反相高效液相色譜法測定了制絲過程中松片回潮、潤葉加料和烘絲3 個工序前后煙絲中的游離氨基酸。張明文等［5］應用離子色譜儀分析了葉絲干燥工序后煙絲游離氨基酸的變化。現有研究報道存在的問題：一是采樣缺乏代表性，通常僅在每個工序段選取一個樣進行簡單比較，結果不具有統計意義；二是檢測方法有局限性，色譜分離中煙草待測組分易受其他成分的干擾而被誤判。關于煙草中游離氨基酸的檢測，國內外多采用氣相色譜法［6］、高效液相色譜法［7-9］、離子色譜法［10］、氨基酸自動分析儀法［11］等。氣相色譜和高效液相色譜因其定性是通過待測組分在標準樣品色譜圖和待測樣品色譜圖中的保留時間對照判定，待測組分和干擾成分共流出的概率很大。離子色譜法和氨基酸分析儀法為行業標準方法，在實際應用中離子色譜法目標氨基酸保留時間容易漂移，且離子色譜法和氨基酸分析儀法同樣存在共流出問題，分析過程中均出現對部分氨基酸峰的干擾情況。

葉絲增溫增濕和葉絲干燥是葉絲制作工藝中的重要工序，且兩個工序均需要對葉絲進行加熱。葉絲增溫增濕工序的主要目的是提高葉絲溫度和含水率，進而提高葉絲的耐加工性。葉絲干燥的工藝目的是降低葉絲含水率并提高葉絲的填充值，滿足后續加工需求。本研究中選取制絲生產線上SIROX 增溫增濕工序和滾筒烘絲工序前后的煙絲樣品，參考黃志等［12］建立的硅烷化衍生-氣相色譜/質譜聯用（GC/MS）方法，對17 種氨基酸進行分離并在選擇離子監測（SIM）模式下進行鑒定，在此基礎上，分析SIROX增溫增濕工序和滾筒烘絲工序中煙絲游離氨基酸含量變化趨勢，旨在為提高卷煙產品內在質量及保持其穩定性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

樣品為某一類卷煙牌號制絲線煙絲樣品（廣東中煙工業有限責任公司廣州卷煙廠提供）。

N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA，99%，美國REGIS 公司）；正亮氨酸（內標，99%）、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、賴氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、酪氨酸和色氨酸（氨基酸標準品，≥99%）（美國Alfa Aesar 公司）；鹽酸（質量分數38%，天津永大化學試劑開發中心）；乙腈（色譜純，德國Merck公司）。

SIROX 增溫增濕設備、6 400 kg/h 葉絲滾筒干燥機、9 600 kg/h 葉絲滾筒干燥機（德國Hauni 公司）。7890B-5977A 氣相色譜-質譜聯用儀（配自動進樣器）、DB-5MS 毛細管色譜柱（60 m × 0. 25 mm , 0.25 μm）（美國Agilent 公司）；CP224S 型電子天平（感量：0.1 mg，德 國Sartorius 公司）；Milli-Q Integral 10 超純水儀（美國Millipore 公司）；Sigma 3-18K 離心機（德國Sigma 公司）。

1.2 方法

1.2.1 工序控制條件

本研究中采樣煙絲涉及6 400 kg/h和9 600 kg/h兩條生產線。有關兩個工序前后煙絲游離氨基酸的變化趨勢研究所用數據基于6 400 kg/h 生產線采樣煙絲，以9 600 kg/h 生產線煙絲作為對比驗證樣品。兩條生產線的SIROX 和滾筒烘絲工序工藝控制條件如下：

（1）6 400 kg/h 生產線。SIROX 增溫增濕工序：入口物料流量：7 000 kg/h；蒸汽流量：380～430 kg/h；出口溫度：（79±2）℃。滾筒烘絲工序：入口物料流量：7 000 kg/h；筒內熱風風速：（0.17±0.01）m/s；筒 壁 溫 度：130～150 ℃；熱 風 溫 度：（130±3）℃；排潮風門開度：70.0%～90.0%；出口煙絲含水率：12.5%～13.5%；出口溫度：（60±5）℃。

（2）9 600 kg/h 生產線。SIROX 增溫增濕工序：入口物料流量：7 500 kg/h；蒸汽流量：380～430 kg/h；出口溫度：（79±2）℃。滾筒烘絲工序：入口物料流量：7 500 kg/h；筒內熱風風速：（0.17±0.01）m/s；筒 壁 溫 度：125～145 ℃；熱 風 溫 度：（100±3）℃；排潮風門開度：60.0%～80.0%；出口煙絲含水率：12.5%～13.5%；出口溫度：（60±5）℃。

1.2.2 煙絲取樣

對SIROX 增溫增濕和滾筒烘絲兩個關鍵工序前后煙絲游離氨基酸的變化進行分析，取樣方法如圖1 所示。（1）取樣點。A：煙絲增溫增濕設備入口處，即SIROX 增溫增濕工序前的煙絲；B：煙絲增溫增濕設備出口處，即SIROX 增溫增濕工序后、滾筒烘絲工序前的煙絲；C：煙絲滾筒干燥機出口處，即滾筒烘絲后的煙絲。（2）取樣方法。在正常制絲過程中，于A、B、C 處，以90 s 為時間間隔，每次取樣150 g，各取樣30 次，將30 次取得的樣品充分混勻，得到4 500 g 的樣本，并從該樣本的不同位置上取出煙絲，作為檢驗樣品。（3）取樣次數。分3 批次取樣，最后得到9 個樣本，分別為A1～A3、B1～B3、C1～C3。

圖1 取樣方式示意圖Fig.1 A schematic diagram of the processes and sampling mode

1.2.3 樣品制備

按照行業標準YC/T 31—1996［13］制備樣品和測定樣品含水率。煙絲粉碎后得到的煙末樣品于低溫（-25 ℃）下保存。

1.2.4 游離氨基酸測定

采用硅烷化衍生-GC/MS 法測定樣品中17 種游離氨基酸：丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、賴氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、酪氨酸和色氨酸。參照文獻［12］的方法測定。

（1）樣品前處理條件。取出低溫下保存的煙末樣品，稱取0.1 g 煙末置于15 mL 玻璃離心管中，加入5 mL 75%乙醇和100 μL 含內標正亮氨酸（1 mg/mL）的0.1 mol/L HCl 溶液，渦旋振蕩1 min。室溫下靜置16 h，再渦旋振蕩1 min，于3 000 r/min下離心3 min，取上清液備用。

（2）硅烷化反應條件。吸取100 μL 上層離心液于樣品瓶中，用氮氣吹干，然后分別加入100 μL乙腈和100 μL MTBSTFA，渦旋振蕩3 min，75 ℃下密閉衍生化反應30 min。冷卻至室溫，取樣進行GC/MS 分析。

（3）GC/MS 條件。色譜柱：DB-5MS 毛細管柱（60 m ×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度：280 ℃；進樣量：1 μL；分流模式：不分流；柱流速：1.2 mL/min；升溫程序：初始溫度80 ℃，保持1 min，以20 ℃/min 的速率升溫至140 ℃，再以3.5 ℃/min的速率升溫至290 ℃，保持15 min；傳輸線溫度：240 ℃；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；溶劑延遲：16 min；電離方式：EI；電離能量：70 eV；掃描方式：選擇離子掃描。

1.2.5 數據分析

采用方差分析（Analysis of variance，ANOVA）考察煙絲經SIROX 增溫增濕和滾筒烘絲工序處理后煙絲游離氨基酸含量變化，具體過程：（1）在A、B 兩組樣品間進行方差分析，氨基酸在兩組樣品間的差異顯著性水平記為P1，若P1＜0.05，則SIROX 增溫增濕工序前后氨基酸的差異程度標記為“*”，為突出差異程度，若P1＜0.01，則標記為“**”；（2）在B、C 兩組樣品間進行方差分析，氨基酸在兩組樣品間的差異顯著性水平記為P2，若P2＜0.05，則滾筒烘絲工序前后氨基酸的差異程度標記為“*”，若P2＜0.01，則標記為“**”。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）法分析不同工序點樣品的氨基酸含量和組成分布。

2 結果與討論

2.1 氨基酸檢測方法的可靠性驗證

將17 種氨基酸的單標標準溶液分別進行硅烷化衍生-GC/MS 分析，結合NIST 譜庫檢索，確定了每個氨基酸衍生物的保留時間和特征離子，除保留時間稍有不同外，氨基酸衍生物的出峰順序和特征離子與文獻［12］結果一致。將煙絲樣品進行硅烷化衍生-GC/MS 分析，并與標樣進行比對，樣品總離子流色譜圖（TIC）見圖2。由硅烷化衍生物的特征EI 質譜圖可知，該方法具有較好的選擇性和特異性。

為確認氨基酸檢測結果的可靠性，對氨基酸檢測方法進行了方法學驗證。結果表明：17 種氨基酸的定量標準曲線線性良好，R2為0.998 9～0.999 9，方法加標回收率為91.4%～113.5%。為進一步驗證硅烷化衍生-GC/MS 法測定煙草中游離氨基酸的準確性，對同一煙絲樣品采用本方法和YC/T 282—2009 標準方法［11］分別平行測定6 次，因氨基酸分析儀法測定天冬酰胺、谷氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸5 種氨基酸存在干擾，因此對丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、酪氨酸和色氨酸12 種氨基酸的測定結果進行了比較。為考察兩種方法所測結果之間的差異顯著性，采用t 檢驗法［14］對兩組結果進行了檢驗，見表1。采用兩種方法分別測定6 次，自由度為10，當置信度為99%（置信水平α=0.01）時，臨界值t10為3.17，將計算所得的|t|值與臨界值t10相比較。從表1 可以看出，丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、組氨酸和色氨酸的|t|值均小于臨界值t10，表明兩種方法的測定結果之間不存在顯著性差異；苯丙氨酸、谷氨酰胺和酪氨酸3 種氨基酸的|t|值大于臨界值t10，對于這3 種氨基酸，本方法的測定值略大于標準方法。總體上，本方法較可靠。因此，選擇硅烷化衍生-GC/MS 法作為煙絲游離氨基酸的分析方法。

圖2 煙絲樣品17 種氨基酸衍生物的TIC 圖Fig.2 TIC chromatogram of derivatives of 17 amino acids in cut tobacco samples

表1 硅烷化衍生-GC/MS 法與游離氨基酸測定標準方法的結果對比Tab.1 Results of free amino acids by silylation derivatization-GC/MS method and the standard method（μg·g-1）

考慮到煙草中17 種氨基酸的含量差異較大，氨基酸檢測結果的穩定性對于加工工序前后煙絲樣品的氨基酸含量變化分析至關重要。對于一些含量較低的氨基酸，如果檢測結果波動較大，則很難判斷樣品中氨基酸的變化是由工序引起還是檢測方法誤差所致。為此，進行了方法重復性考察。取同一煙末樣品，平行稱取6 份試樣，采用1.2節方法進行測試，計算測試結果的相對標準偏差（RSD），結果見表2。可以看出，17 種氨基酸測定值的RSD 在0.7%～4.0%之間，表明方法精密度良好，可以滿足實驗要求。

2.2 氨基酸檢測結果

運用本方法，對A1～A3、B1～B3、C1～C3 等9 個樣品進行檢測，每個樣品平行測定兩次，結果取平均值，得到不同工序段煙絲樣品氨基酸含量，并計算了3 個批次樣品氨基酸含量的相對標準偏差（RSD）。結果顯示：在第1 個工序點（SIROX 前），3 個批次樣品中17 種氨基酸含量的RSD 值為1.0%～4.4%；在第2 個工序點（SIROX 后/烘絲前），17 種氨基酸含量的RSD 值為0.7%～4.7%；在第3 個工序點（烘絲后），17 種氨基酸含量的RSD 值為0.4%～2.6%。同一工序點、不同批次樣品間氨基酸含量差異（RSD≤4.7%）與檢測方法造成的差異（RSD≤4.0%）相當，表明不同批次煙絲的一致性較好，所選取的樣品可以反映相應制絲工序點的煙絲狀態。

表2 氨基酸檢測方法精密度測試結果Tab.2 Precision test results for amino acid quantification （μg·g-1）

2.3 氨基酸含量變化趨勢

為明確SIROX 增溫增濕工序和滾筒烘絲工序對煙絲氨基酸的影響，將A（SIROX 前）、B（SIROX后）和C（烘絲后）3 個關鍵工序點（圖1）所取煙絲樣品氨基酸含量以誤差棒的形式顯示（圖3），并采用方差分析對17 個氨基酸組分進行分析。

由方差分析原理可知，當組間差異（制絲工序的影響）遠大于組內差異（不同批次樣品間的差異），各組間差異有統計學意義。因此，P1＜0.05，表示煙絲經SIROX 增溫增濕工序后氨基酸含量發生顯著性變化；同樣，P2＜0.05，表示煙絲經滾筒烘絲工序后氨基酸含量發生顯著性變化。由圖3可知：

（1）在SIROX 增溫增濕工序前后發生顯著性變化（*，P1＜0.05）的氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸，其中纈氨酸、絲氨酸、蘇氨酸為極顯著變化（**，P1＜0.01）。據文獻報道，煙葉在較高溫和高濕的環境下調制時，可溶性蛋白質會發生降解，進而導致氨基酸含量的增加［15］。從圖3 可以看出，煙絲經過SIROX 增溫增濕工序后，丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸含量均呈上升趨勢，這可能與該工序較高的溫度和濕度有關。

（2）在滾筒烘絲工序前后發生顯著性變化（*，P2＜0.05）的氨基酸包括纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、組氨酸、酪氨酸、色氨酸，其中絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、酪氨酸為極顯著變化（**，P2＜0.01）。17 種氨基酸中，有12 種氨基酸的含量發生了顯著性變化，且均呈下降趨勢。有研究［5］表明，100 ℃下，大多數氨基酸可與糖發生非酶棕色化反應，并且適當的煙絲含水率（12.5%～13.5%）有利于非酶棕色化反應的發生。在本研究的滾筒烘絲工序中，筒壁溫度為125～145 ℃，熱風溫度（100±3）℃，出口煙絲含水率12.5%～13.5%，這些條件適宜于非酶棕色化反應，而氨基酸參與非酶棕色化反應會導致其含量降低。

為進一步分析氨基酸含量的變化幅度，計算了A、B、C 3 個取樣點煙絲樣品的氨基酸平均變化量。因17 種氨基酸含量存在數量級差異，為便于比較，變化幅度以相對變化量計，變化幅度=［（工序后值-工序前值）/工序前值）×100%］，結果見圖4。從總體上來看：在SIROX 增溫增濕工序階段，丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、絲氨酸和蘇氨酸6 種氨基酸含量有所增加，增幅介于3.9%～8.3%；滾筒烘絲工序中，纈氨酸、亮氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸5 種氨基酸含量有所降低，降幅介于1.7%～3.0%。氨基酸在兩個工序過程中的顯著變化趨勢，推測可能與蛋白質降解反應和非酶棕色化反應有關。其中在SIROX 增溫增濕工序階段，由于高濕度條件導致煙絲含水率過高，過量水分對非酶棕色化反應有抑制作用［2］，因此該階段蛋白質降解反應占主導作用，表現為部分氨基酸含量升高；在滾筒烘絲工序，適宜的溫度和濕度等條件下部分氨基酸可能發生了一定程度的非酶棕色化反應，因此含量呈現降低趨勢。

圖3 不同工序段煙絲氨基酸含量變化趨勢圖（n=3）Fig.3 Variations of amino acid contents in cut tobacco at different process stages（n=3）

圖4 6 400 kg/h 制絲線煙絲經過SIROX 和滾筒烘絲工序后氨基酸含量變化Fig.4 Variations of amino acid contents in cut tobacco after SIROX and cylinder drying processes in a 6 400 kg/h primary processing line

為探討上述煙絲游離氨基酸在兩個工序間的變化趨勢是否只適用于生產線的特定工藝參數，對同一牌號另一條9 600 kg/h 生產線的煙絲進行了取樣分析，分析方法同6 400 kg/h 生產線的煙絲。兩條生產線物料流量相差不大，9 600 kg/h生產線熱風溫度和筒壁溫度略高于6 400 kg/h 生產線。9 600 kg/h 生產線煙絲游離氨基酸在SIROX 和滾筒烘絲工序前后的變化情況見圖5。可以看出，17種游離氨基酸經SIROX 后含量均呈增加趨勢，經滾筒烘絲工序后含量均呈現降低趨勢，兩條生產線變化趨勢一致；兩條生產線煙絲游離氨基酸變化幅度不同，但均小于10.0%。可見，在SIROX 增溫增濕和滾筒高溫烘絲的條件下，煙絲游離氨基酸的變化趨勢較為一致。

圖5 9 600 kg/h 制絲線煙絲經過SIROX 和滾筒烘絲工序后氨基酸含量變化Fig.5 Variations of amino acid contents in cut tobacco after SIROX and cylinder drying processes in a 9 600 kg/h primary processing line

2.4 3 個工序點煙絲氨基酸的總體輪廓

為進一步了解A、B 和C 3 個關鍵工序點煙絲中氨基酸組成和含量分布情況，采用主成分分析對9 個樣品進行了分析，前2 個主成分因子累計方差貢獻率為84%，其中第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）方差貢獻率分別為70%和14%，因此提取前2 個主成分概括煙絲氨基酸的總信息量，對樣品進行綜合評價。9 個樣品在第一主成分和第二主成分的空間內投影見圖6。可以看出，3 個工序點樣品在主成分空間可很好地相互區分開，3 個工序點的樣品各自聚為一類，表明3個工序點的煙絲氨基酸組成和含量分布存在明顯差異。從A 工序點到C 工序點，煙絲中的部分氨基酸含量先增后降，但其組成和含量未恢復至加工前。

從各氨基酸在第一主成分和第二主成分的載荷（圖6）來看，總體上B 工序點的煙絲氨基酸含量高于其他兩個工序點；對于A 到C 工序點，兩組樣品的最大區別在于，A 工序點煙絲中組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、天冬氨酸和酪氨酸含量相對較高，C 工序點煙絲中纈氨酸、異亮氨酸、絲氨酸和甘氨酸含量相對較高。可見，在SIROX 增溫增濕工序和滾筒烘絲工序中發生蛋白質降解反應產生氨基酸、非酶棕色化反應消耗氨基酸，但不同氨基酸的反應速度不同，從而導致3 個工序點煙絲的氨基酸含量組成出現差異。

圖6 不同工序點煙絲氨基酸的主成分分析雙圖Fig.6 Principal component analysis bi-plot of amino acids in cut tobacco samples from different process points

3 結論

煙絲經過SIROX 增溫增濕工序處理后，丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、絲氨酸和蘇氨酸6 種氨基酸含量增加，增幅介于3.9%～8.3%。煙絲經過滾筒烘絲工序處理后，纈氨酸、亮氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸5 種氨基酸含量降低，降幅介于1.7%～3.0%。主成分分析結果顯示，兩個關鍵工序前后3 個工序點煙絲樣品能較好地區分開，表明煙絲經SIROX 增溫增濕工序和滾筒烘絲工序處理后，其氨基酸含量和組成發生了明顯變化。游離氨基酸的變化與工藝參數密切相關，在后續研究中將繼續深化筒壁溫度等工藝參數對氨基酸變化趨勢的影響研究，以進一步考察制絲過程對煙絲氨基酸的影響。