非極性柱下保留指數結合GC-MS/MS 分析煙草香味成分

任宗燦，陳 黎，史天彩，王曉瑜，崔華鵬，謝復煒，劉惠民

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001

煙草香味成分既是煙葉又是卷煙風格和品質的物質基礎。獲得正確的煙草香味成分定性、定量分析數據對卷煙風格剖析、卷煙產品的安全控制至關重要。目前行業普遍采用GC-MS 法結合通用型商業GC-MS 譜庫對煙草香味成分進行定性分析［1-4］。由于煙草中成分極其復雜、質量分數差異較大，常有重疊峰出現，GC-MS 法需要進行解卷積扣除背景等處理以提高譜庫匹配的準確性［5-6］。對于低質量分數、多指標的檢測方法，該過程既顯得繁瑣復雜，又難以實現可靠的高匹配度結果。GC-MS/MS 法靈敏度高、檢出限低、定性準確、抗干擾能力強，可以將在色譜分離過程不能完全分開的具有不同母離子的共流出物通過設置動態多反應監測模式（dMRM）分離［7-8］。目前已有報道采用GC-MS/MS 法測定煙草香味成分，但覆蓋目標物種類及數量皆較少［9-10］。dMRM 模式的定性依據是目標物的保留時間和特征離子對信息，目標物的準確保留時間及離子對信息需通過標準品獲取。但煙草成分中含有大量的同分異構體及結構近似的香味成分，人工合成的標準品也常為異構體混合物，異構體質譜圖之間差別不明顯，僅依據譜圖匹配結果無法明確標準品中色譜峰的歸屬，導致異構體之間難以區分。另一方面，在實驗室日常檢測中，當儀器維護（如更換或切割色譜柱）后，目標物保留時間會發生改變。多靶標的GC-MS/MS 法由于目標物繁多、掃描信息少（僅為特征離子對信息，無法進行譜圖匹配）以及掃描時間窗口窄（目標物保留時間偏離出時間窗口則無法進行掃描采集）等問題導致重新確定目標物的保留時間會耗費大量時間及精力。

保留指數（Retention index, RI）的概念由Kovats 在1958 年提出［11］。RI 表示物質在固定液上的保留值行為，當固定相確定時，物質的RI 與柱溫成線性相關且毛細管色譜柱的極性越小RI 的重現性越好［12］。即當色譜條件確定時，目標物的RI為與其保留時間有關的常數。基于此原理，在復雜樣品體系中，采用RI 結合GC-MS 譜庫匹配可以明顯提高同分異構體定性結果的準確性和可靠性。利用GC-MS 法結合RI 進行定性分析已廣泛應用于食品、香精香料和煙草等領域［12-17］。然而通用型商業GC-MS 譜庫RI 信息不全，往往導致一些重要煙草香味成分無法被準確定性；另一方面，由于RI 具有良好的穩定性，且RI 與保留時間之間又存在一一對應關系，在多靶標GC-MS/MS 方法中，利用RI 可以快速調整目標物的掃描時間窗口。在煙草領域，RI 多被應用于輔助定性分析目標成分，而利用RI 確定多靶標GC-MS/MS 法采集時間窗口的研究鮮有報道。因此，通過檢測標準品確定了241 種煙草香味成分的RI，并探究了其在確定GC-MS/MS 方法采集時間窗口中的應用，旨在為煙草香味成分的快速分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

2016 年云南曲靖產C3F 等級K326 煙葉樣品。4 種檢測用煙葉樣品：1#為2015 年云南產清香型B2F 等級CB-1 煙葉，2#為2015 年云南產清香型X2F 等級CB-1 煙葉，3#為2015 年河南產濃香型B2F 等級中煙100 煙葉，4#為2015 年河南產濃香型X2F 等級中煙100 煙葉。

QuEChERS 萃取試劑盒（4 g 硫酸鎂+ 1 g 氯化鈉，美國Agilent 公司）；過濾工具包（尼龍，13 mm×0.22 μm）；241 種標準品（標準品信息見表1）；苯乙酮-d8（98 atom% D）、正構烷烴標準品C7～C40（美國Sigma-Aldrich 公司）；磷酸（AR，天津市科密歐化學試劑有限公司）；磷酸二氫鈉（AR，天津市致遠化學試劑有限公司）；乙腈（色譜純，美國J T Baker 公司）。

7890B-7000D 氣相色譜/三重四極桿質譜聯用儀（美國Agilent 公司）；EOFO-945066 多管式旋渦混合器（美國Talboys 公司）；3-30KS 高速冷凍離心機（德國Sigma 公司）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）；CPA225D 電子天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius 公司）。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

內標工作溶液：準確稱取30 mg 的苯乙酮-d8標準品，然后用乙腈溶解并定容至10 mL，得3 000 mg/L 的內標儲備液，于-18 ℃冰箱中儲存；取0.1 mL 內標儲備液于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容，配制成30 mg/L 的內標工作液。

混標工作液：準確稱取100 mg 標準品（精確至± 0.1 mg），用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成10 000 mg/L 的單標儲備液。準確移取0.1 mL 各單標儲備液于50 mL 容量瓶中，用乙腈定容，配制成20 mg/L 的混標工作液。

1.2.2 樣品前處理

將實驗所用煙葉研磨成粉，過孔徑0.450 mm（40 目）篩。準確稱取2 g 樣品于50 mL 具塞離心管中，依次加入0.1 mL 混標工作液、10 mL 磷酸鹽緩沖溶液，以使樣品完全浸潤，靜置20 min。加入0.1 mL 內標工作液、10 mL 乙腈，以2 500 r/min 渦旋萃取2 min，隨后放入－18 ℃的冰箱中冷凍10 min。取出后加入4 g 無水硫酸鎂、1 g 氯化鈉并迅速劇烈搖晃，再以2 500 r/min 渦旋2 min，8 000 r/min 離心3 min。取1.5 mL 上清液，加入0.2 g 無水硫酸鎂，立即以2 500 r/min 渦旋2 min，8 000 r/min離心3 min；將上清液過0.22 μm 有機相濾膜，進行GC-MS/MS 檢測。分析條件：

色譜柱：DB-5MS UI 彈性石英毛細管柱（60 m× 0.25 mm × 0.25 μm），進樣口端串聯預柱（5 m ×0.25 mm）；進樣口溫度：290 ℃；程序升溫：50 ℃min）；進樣模式：不分流進樣，不分流時間1 min；載氣：氦氣（99.999%）；恒流流速：1.5 mL/min；進樣量：0.8 μL。電離模式：電子轟擊（EI）；電離能量：70 eV；燈絲電流：35 μA；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；Q2 碰撞氣：氮氣（99.999%），流量1.5 mL/min；淬滅氣：氦氣（99.999%），流量2.25 mL/min；掃描方式：動態多反應監測（dMRM）。

2 結果與討論

2.1 241 種煙草香味成分RI 的測定

241 種煙草香味成分選自美國煙草添加劑清單［18］、BAT 煙草添加劑清單［19］、英國煙草添加劑清單［20］，包含了醛、酮、醇、酚、烴、醚、酯、內酯、吡啶和吡嗪等揮發性、半揮發性香味成分、潛香成分。

在程序升溫條件下，目標化合物RI 的計算采用正構烷烴系列作為參考，計算公式為：

式中：x、z、z+1 分別為目標化合物以及其流出前后相鄰正構烷烴的碳原子數，t（x）、t（z）、t（z+1）分別為目標化合物以及其流出前后相鄰正構烷烴的保留時間。241 種煙草香味成分RI 的測定結果見表1，RI 和RI*分別為本實驗測得的和NIST 庫中非極性柱上的程序升溫保留指數。可知，212 種目標化合物的RI 與RI*差值皆小于10，表明目標物在非極性柱上的重現性良好，實驗所得RI 數據可以為非靶標檢測方法提供輔助定性依據。此外，本實驗中新補充了25 種NIST17 庫中未收錄成分的RI，其中包括一些重要的香味成分，如西瓜酮和1-（2,6,6-三甲基-2-環己烯基）-1-戊烯-3-酮等。

表1 241 種目標成分的預測保留時間和實際測得保留時間①Tab.1 Predicted retention times and measured retention times of 241 target components

表1 （續）

表1 （續）

表1 （續）

表1 （續）

表1 （續）

2.2 RI 在同分異構體區分中的應用

煙草基質是化學組成極其復雜的體系，其中含有大量的同分異構體。通常所購買的標準品也為異構體混合物。同分異構體的結構相似，質譜圖差別不大，僅依靠譜圖匹配難以區分標準品中的同分異構體，而結合RI 輔助定性可以明顯提高結果的準確性。例如檸檬醛包含順式和反式兩種構型，即橙花醛（編號213）和香葉醛（編號216），天然提取及化學合成的檸檬醛皆為兩種異構體的混合物。檸檬醛標準品的總離子流圖及色譜峰1和2 所對應的質譜圖如圖1 所示。NIST 譜庫檢索結果表明：峰1 與橙花醛和香葉醛的匹配度分別為86%和85%，峰2 與橙花醛及香葉醛的匹配度分別為84%和85%。因此無法通過譜圖匹配來確定兩者的色譜峰。文獻［21］報道，橙花醛與香葉醛的RI 分別為1 232 和1 266，即出峰順序為橙花醛在前、香葉醛在后，由此可初步判定檸檬醛標準品總離子流圖中峰1為橙花醛、峰2為香葉醛。且由本實驗所測峰1及峰2的RI分別為1 234和1 263，與文獻值相近，進一步確認峰1為橙花醛、峰2為香葉醛。

圖1 檸檬醛標準品總離子流圖（a）以及色譜峰1（b）和色譜峰2（c）的質譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of citral (a) and mass spectra of chromatographic peaks 1 (b) and 2 (c)

某些香料不同構型的異構體對于煙氣香吃味的影響不同。天然玫瑰醚為順式結構，人工合成的玫瑰醚一般為異構體的混合物。與反式玫瑰醚相比，順式玫瑰醚的玫瑰香味更強烈，香味閾值更低。合成的玫瑰醚中順式結構的質量分數越高香氣越好，因此檢測時需要對兩者進行明確區分。玫瑰醚標準品的總離子流圖及色譜峰所對應的質譜圖見圖2，譜圖匹配顯示標準品中兩個色譜峰皆為順式玫瑰醚。實測兩峰對應化合物的RI 分別為1 108、1 124，既往報道稱順式玫瑰醚［22］和反式玫瑰醚［23］的RI 分別為1 109 和1 126，因此可以確認峰1 和峰2 分別為順式和反式玫瑰醚。

圖2 玫瑰醚標準品總離子流圖（a）以及色譜峰1（b）和色譜峰2（c）的質譜圖Fig.2 Total ion current chromatogram of rose oxide (a)and mass spectra of chromatographic peaks 1 (b) and 2 (c)

2.3 RI 在dMRM 方法時間窗口校正中的應用

在超多靶標分析方法中，大量時間窗口的互相重疊、堆積會導致每對離子對的駐留時間縮短，使采集的色譜峰數據點減少，甚至無法采集數據。因此，為了保證色譜峰有足夠的數據點且每對離子對有足夠的駐留時間，一般會盡可能縮小時間窗口，如本方法中各目標物時間窗口僅為0.6 min，即儀器僅在各目標物保留時間前后0.3 min內掃描其特征離子對。在多靶標dMRM 方法實驗室日常檢測中，儀器常規維護（如更換或切割色譜柱）后，目標物的保留時間會發生漂移，時常出現目標物色譜峰偏移出時間窗口而無法采集數據的情況，影響方法的定性定量結果。由于目標物眾多且保留時間的重疊干擾，若采用全掃描模式確定各目標物準確保留時間則需要分組進樣檢測，實驗過程及數據處理花費時間長。利用所建立的RI 庫可以快速、準確地獲得各目標物的保留時間，大大減少保留時間校正的工作量。

在更換色譜柱后，首先采用相同的程序升溫條件對正構烷烴混合標準工作液進行全掃描檢測，獲取正構烷烴的保留時間。其次將各目標物的RI 及其相鄰正構烷烴的保留時間代入公式（1）獲得241 種煙草香味成分的計算保留時間。最后以計算保留時間±0.3 min 創建時間窗口，建立dMRM 方法對目標物混標工作液進行檢測，獲得各目標物的準確保留時間。根據計算保留時間所創建的時間窗口能否覆蓋目標物的準確保留時間判定該方法是否可行。各目標物計算保留時間與準確保留時間的結果見表1。可知，241 種目標物計算保留時間與準確保留時間的差值皆小于0.3 min，其中232 種的 差 小于0.05 min、9 種 的差在0.05 ～0.10 min 內。各目標物準確保留時間皆在依據計算保留時間所建立的時間窗口范圍內。證明利用所建立的RI 庫快速確定目標物保留時間可行。該策略可以有效縮短實驗室日常維護工作時長，也可以在無標準品的情況下建立煙草香味成分的dMRM 分析方法。

2.4 實際樣品檢測結果分析

利用化合物的RI 信息建立針對煙草241 種香味成分的dMRM 定性分析方法，并檢測了4 個煙葉樣品，共檢測出89 種化合物（表2），以此針對性地完善靶向定量方法。在4 種煙葉樣品中巨豆三烯酮的質量分數最高，其次是1-（2,6,6-三甲基-2-環己烯基）-1-戊烯-3-酮、3-甲基-2,5-呋喃二酮、地芰普內酯、苯乙醛和2（5H）-呋喃酮。

表2 4 種煙葉樣品的檢測結果Tab.2 Detection results of 4 tobacco leaf samples

表2 （續）

3 結論

通過RI 概念結合GC-MS/MS 技術建立了針對241 種煙草香味成分的檢測方法，探究RI 在該方法中的應用：①建立了針對DB-5MS UI 色譜柱的RI 庫，包括241 種煙草香味成分，其中25 種成分的RI 還未被NIST17 收錄，完成了部分同分異構體RI 值的確認，可為煙草香味成分分析提供參考；②提出了利用RI 快速準確矯正dMRM 掃描時間窗口的方法，縮短了多靶標檢測方法實驗時長；③探索了一種根據RI 建立煙草香味成分定性檢測方法的新策略，有助于在無靶標的未知盲樣檢測工作中快速篩選靶標，針對性地建立定量方法，有效降低實驗成本。