不同的呼吸道取樣方法在COVID-19核酸檢測中的應用

賈叢康 張紹剛

聯勤保障部隊第九八三醫院干三科，天津市 300142

2019年12月，武漢市報道了多例不明原因肺炎病例，隨后在全世界多國暴發流行。中國科學院武漢病毒所通過病毒分離、核酸測序，明確了其致病因子是新型冠狀病毒[1]。世界衛生組織將此病毒命名為2019新型冠狀病毒( 2019 novel coronavirus，2019-nCoV)。 2月11日國際病毒分類委員會冠狀病毒研究小組將其正式命名為嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2型(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)；對于這種病毒引起的肺炎命名為新型冠狀病毒肺炎 (Coronavirus disease 2019，COVID-19)。該流行病潛伏期長，傳染性強，臨床癥狀多樣，發病機制不明確，目前尚無特效治療措施，因此及早發現SARS-CoV-2感染者和攜帶者并進行有效的隔離與治療，是目前防止疾病播散最有效的方法。隨著SARS-CoV-2基因組序列的公布，多項核酸和抗體檢測試劑盒被設計開發并投入使用，其中比較成熟、易于實施的核酸檢測是確診SARS-CoV-2感染的重要依據，高危人群的核酸檢測也成為防控的有效措施。在流行病學調查及臨床診治新冠肺炎的實踐中，常出現呼吸道取樣核酸檢測假陰性的現象，嚴重的干擾我們的防控措施。不同部位的標本可能會影響檢測陽性率的偏差。因此不同的取樣方法獲取標本影響檢測結果，故本文對上呼吸道采樣(鼻咽、口咽、舌及漱口液)和下呼吸道采樣(痰、氣管及支氣管肺泡)的不同方法進行綜述。

1 上呼吸道采樣

1.1 鼻咽及口咽取樣 咽部分區包括鼻咽、口咽及喉咽，三者的黏膜是連續的，均屬于上呼吸道的區域(見圖1)，經口取樣是口咽拭子(OPS)也被稱為“咽喉拭子”。它是指對四個口咽腔(扁桃體、軟腭、舌根和咽后壁)中的一個或多個進行取樣(見圖2)?？谘饰挥诳谇缓竺?，開始于硬軟腭的過渡區。OPS最常見的靶點是咽后壁，因為它是鼻咽的解剖連續體。在目前的COVID-19爆發中， OPS是最常用的呼吸道取樣方法。一項早期重要的研究詳細描述了武漢COVID-19患者的臨床特征，將OPS作為唯一的呼吸取樣方法[2]。然而，據報道OPS的陰性預測值較低。Xie等[3]報道19例血清陽性的COVID-19患者，只有9例(47%)OPS是陽性的，提示從多個部位重復取樣對提高診斷率非常重要?？谘适米尤臃奖?，張口就能進行操作，相對簡單，受試者痛苦較小，因此臨床上比較常用，但取樣者暴露的風險更高，操作者往往需要正對患者口腔，采集過程中患者容易出現刺激性干咳，嘔吐等癥狀使采集者暴露在帶病毒的氣溶膠中。

圖1 鼻—口—喉咽部示意圖

圖2 口咽拭子取樣示意圖

經鼻取樣是鼻咽拭子，鼻咽拭子(NPS)需要將植絨拭子棒深深地插入鼻咽，以實現與鼻咽后壁的直接接觸(見圖3)。在目前的COVID-19大流行中，已有文獻對鼻咽拭子(NPS)與口咽拭子(OPS)的比較。Zou等[2]的一項研究中，對18名COVID-19患者的72個中鼻甲和鼻咽的樣本進行了分析。在這些樣本中檢測到較高的病毒載量，高于同一組患者中檢測到72個OPS樣本。但這種多點取樣耗時，消耗大量緊缺資源，不適合在大流行情況下進行大規模篩查。經實驗室檢測比較發現，鼻咽拭子的SARS-CoV-2核酸陽性率明顯高于口咽拭子[4]。鼻咽拭子相對口咽拭子優點：(1)可以在咽部停留較長時間，以便獲得更足量的標本，這也是文獻報道其陽性率高于口咽拭子的原因；(2)取樣者的暴露風險相對口咽拭子更低，因為取樣時我們取樣者是可以站在患者側后方操作，且要求患者下拉口罩僅露出鼻孔，遮住口腔，不需要直視患者口腔，而且基本不出現咽反射，少數患者取樣后可能出現噴嚏反射，患者可用手肘或紙巾遮蔽，且因為取樣者不在患者正前方，暴露風險相對更低，減輕取樣者的心理壓力。缺點是相對口咽拭子患者心理恐懼更大，取樣者更多的專業培訓。

圖3 鼻咽拭子取樣示意圖

無論是采集鼻咽拭子還是口咽拭子，采集的深度和與黏膜接觸的時長是關鍵。如果采集鼻咽拭子沒有采到鼻咽腔深處，采集口咽拭子時患者嘔吐反應較大導致取樣時間不夠，這時可能采集到的細胞絕大部分都是不含病毒的細胞，即可能造成“假陰性”。這也可能是目前報道的多次核酸檢測陰性患者在復查時又出現核酸陽性的其中一個原因。我國的一項研究中比較了NPA和OPS方法，回顧了SARS、MERS和H1N1呼吸取樣文獻，得出結論：在所有上呼吸道取樣方法中，鼻和口咽聯合拭子(NS+OPS)對醫務人員的危害最小[5]。上述結果是否可以推斷為SARS-CoV-2尚待評估。

1.2 舌拭子、口腔拭子及漱口水取樣 用于檢測SARS-CoV-2的舌拭子(LS)或口腔拭子(OCS)包括擦拭舌頭或口腔的前三分之二。武漢的一項研究[6]發現，91例COVID-19患者OPS陽性率高于LS。Azzi等[7]報道使用OCS和“口服唾液吸管收集”進行病毒檢測。25名重癥監護室機械通氣的COVID-19患者，所有患者的唾液拭子中檢測到SARS-CoV-2，具有不同的Ct值(范圍18.12～32.23，平均值27.16±3.07)。所有患者鼻咽拭子都是陽性。該文認為口腔唾液收集是一種可靠的病毒檢測方法。然而，應該注意的是，這些結果來自體內病毒量較多危重患者。因此，在篩選方案中，口腔唾液拭子或LS的用途可能不可重復。盡管LS或OCS很簡單，而且可能引起的不適較少，但由于需要最大限度地現場采樣分泌物，以準確診斷感染，因此在當前的形勢下不太可能普遍使用。

由于咽拭子采樣方法可能引起噴嚏、咳嗽和干嘔，因此在獲取拭子樣本時，醫護人員的接觸風險是存在的。Saito等[8]報道，使用漱口水作為拭子取樣的安全和敏感的替代方法。用10ml生理鹽水漱口取樣與OPS比較1例COVID-19患者在發病第8天和第9天的情況。值得注意的是，在漱口液樣本中發現了更多的病毒基因組，然而這只是1個病例報告。先前有報道稱，對于甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒等呼吸道病原體，漱口水比咽拭子更敏感[9]在本次疫情中，沒有更多文獻報道漱口水對病毒檢測的敏感性和特異性。

2 下呼吸道取樣

深部痰液和灌洗液等下呼吸道標本是核酸檢測的首選，但由于取樣困難，目前篩查多使用鼻咽拭子進行檢測[10]。痰標本可在自主咳嗽或外界刺激咳嗽時收集。在一項小樣本研究中，對10名COVID-19患者進行痰液收集，檢測結果均為陽性；該群患者90%的鼻咽拭子標本中檢測到SARS-CoV-2 RNA，但有10%的樣本(1名患者)為陰性[11]。Pan等[12]也證實了痰標本對SARS-CoV-2病毒檢測的優越性，證實痰樣本的病毒載量通常高于咽喉拭子。在機械通氣患者中，可通過從氣管插管中抽吸或氣管切開術后直接氣管抽吸獲得痰標本，檢出率更高。中國麻醉學學會公布了對重癥COVID-19患者氣管插管的建議，插管過程中大劑量接觸載有病毒的氣溶膠，除非絕對必要，否則應避免，收集氣管抽吸物進行病毒檢測對醫護人員構成重大風險[13]。Huang等[14]道了16例插管COVID-19患者的上呼吸道樣本與氣管內抽吸物的病毒載量比較，發現后者的病毒RNA值明顯高于鼻拭子和口咽拭子等呼吸取樣方法，而且能在重癥監護病房機械通氣患者病毒載量的連續監測中發揮作用。

最早的SARS-CoV-2基因鑒定是通過武漢病毒學研究所的支氣管肺泡灌洗(BAL)樣本進行的[1]。支氣管肺泡灌洗(BAL)是一種下呼吸系統取樣，在這種取樣中，支氣管鏡直接插入氣管和支氣管，行肺泡灌洗，然后收集灌洗液進行檢查。中國和歐洲關于使用BAL樣本檢測SARS-CoV-2病毒的研究已經大量發表[15-16]，證據表明，BAL可降低假陰性率，可以對高度懷疑而OPS陰性的病例中進行病毒檢測[17]。在武漢對4 880名疑似COVID-19患者[疑似COVID-19患者的病例定義：(1)典型的呼吸道感染癥狀，如發熱、咳嗽和呼吸困難；(2)與SARS-CoV-2患者密切接觸]的研究中，Liu等[18]發現BAL在SARS-CoV-2檢測中的陽性率最高，并報告NS和OPS的聯合陽性率為38.25%，而收集的痰的陽性率為49.12%。

綜合研究表明，下呼吸道標本尤其是BAL，往往比上呼吸道標本對肺炎的診斷率更高，高度懷疑而診斷不明確或咽拭子檢測為陰性的患者，為明確診斷應盡可能獲得該標本。然而，下呼吸道取樣涉及更大的技術難度和暴露風險。BAL作為篩選工具也是不可接受的。因此，盡管目前的文獻越來越強調NPS和OPS的局限性和可能的假陰性結果，但上呼吸道取樣仍然是最可行方法。

核酸檢測在COVID-19的防治工作中非常重要。假陰性的危害是將受感染的患者釋放回社區繼續進行病毒傳播，從公共衛生的角度來看，有SARS-CoV-2感染癥狀，但核酸檢測呈陰性的患者，應該多次接受檢測，并要求居家隔離，避免到公共場所。臨床醫生對COVID-19的診斷必須建立在一個以上的檢測基礎上，并考慮患者的風險易感性及接觸史。目前多國建議用鼻咽和口咽蜂窩狀拭子采集樣本進行SARS-CoV-2病毒檢測[19]雖然這些方法有其局限性，但容易開展快速篩查，作為大多數國家檢測、隔離感染者的可實施戰略。下呼吸道采樣方法缺乏快速篩查的能力。

SARS-CoV-2與存在于呼吸黏膜、心臟、腎臟、內皮和腸組織中的血管緊張素轉換酶2(ACE2)受體具有親和力[20]。因此，許多其他標本取樣方法如血液、尿液和糞便標本的采集已被報道，但還有待進一步研究。國內在復工復產的同時，也面臨疫情反彈的壓力，所以做好高危人群的檢測是重要一環，選擇合適的取樣方法盡可能的提高患者配合度，減少假陰性率，仍任重道遠。