miR-103和AXIN2在彌漫大B細胞淋巴瘤中的表達及意義

王姣 劉蜀蓉 龔玉萍

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是臨床最常見的非霍奇金淋巴瘤(non Hodgkin lymphoma，NHL)，目前其發病率在各年齡段均呈上升趨勢。由于DLBCL在免疫表型、生物學特性、預后等方面具有較大異質性，因此探討新的分子標記物對DLBCL進行準確的臨床分型，及提示預后方面具有重要意義。微小RNA-103(MicroRNA-103，miR-103)參與調控各種生物學功能過程，其在多種腫瘤發生、發展過程中發揮重要作用[1]。而軸抑制因子2(Axis inhibitor 2，AXIN2)異常表達可影響細胞正常生長發育，與多種實體腫瘤發生及預后有關[2]。已有研究報道，miR-103、AXIN2與多種疾病發展進程及不良預后關系密切[3,4]，而與DLBCL的關系尚不明確。鑒于此，本研究通過檢測DLBCL組織中miR-103、AXIN2表達，并分析其與DLBCL患者臨床特征、分型及預后關系。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年1月至2013年12月在本院接受手術治療的彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)患者110例作為受試對象，將術中切除腫瘤組織分為兩部分，一部分常規石蠟包埋，另一部分保存于-80℃低溫環境中。110例DLBCL患者男62例，女48例；年齡20～75歲，平均年齡(58.79±15.02)歲；Ann Arbor分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期38例，Ⅲ期25例，Ⅳ20例；淋巴瘤國際預后指數(IPI)評分：低危組(0～2)分50例，高危組(3～5)分60例；血清乳酸脫氫酶(LDH)水平<245 U/L 47例，LDH水平≥245 U/L 63例；血β2微球蛋白(β2-MG)水平<3 mg/L 59例，β2-MG水平≥3 mg/L 51例。另選取同期行手術治療的85例淋巴結反應性增生患者作為對照組，男49例，女36例；年齡21～74歲，平均年齡(57.46±14.93)歲。所有受試者知情同意，簽署知情同意書。本研究經四川大學華西醫院倫理委員會批準。2組患者一般資料比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 入選與排除標準 入選標準：(1)均符合DLBCL診斷標準[5]；(2)術前均未接受放、化療；(3)術中切除組織均可用；(4)臨床資料完整。排除標準：(1)伴有其他血液系統疾病；(2)存在溝通障礙；(3)女性妊娠或哺乳期；(4)存在嚴重肝、腎功能障礙。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化EnVision兩步法檢測蛋白表達：采用免疫組化EnVision兩步法檢測110例DLBCL組織中CD10、BCL-6、MUM1、AXIN2蛋白表達。CD10、BCL-6、MUM1即用型抗體均購自上海信裕生物科技有限公司，兔AXIN2多克隆抗體購自北京百諾威生物科技有限公司。結果判定：CD10、BCL-6、MUM1、AXIN2均定位于胞核，隨機選取每張切片5個高倍視野(400×)，由兩位經驗豐富醫師共同統計陽性細胞染色情況。陰性(-)：無陽性細胞染色或陽性細胞染色≤10%；陽性(+)：陽性細胞染色>10%。根據CD10、BCL-6、MUM1染色結果，并結合Hans分類標準[6]：110例患者中生發中心B細胞樣(germinal center B-cell-like，GCB)型52例，非生發中心B細胞樣(non-germinal center B-cell-like，non-GCB)型58例。

1.3.2 實時定量PCR檢測miR-103、AXIN2 mRNA水平：采用實時定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)檢測組織中miR-103、AXIN2 mRNA表達水平。按照Trizol法提取DLBCL組織中總RNA，并將其反轉錄為cDNA，隨后以cDNA為模板進行擴增，miR-103內參為U6、AXIN2 mRNA內參為GAPDH。反應條件為：95℃，預變性30 s；95℃，變性10 s；65℃，退火10 s；72℃，延伸15 s；合計40個循環，完成后觀察擴增產物特異性。重復3次后整理數據，采用2-ΔΔCt計算miR-103、AXIN2 mRNA相對表達量。本研究以miR-103、AXIN2 mRNA相對表達量<均值者為低表達，≥均值者為高表達。引物序列均由北京睿博興科生物技術有限公司合成。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 隨訪：110例DLBCL患者出院后，由專人以電話形式進行隨訪，隨訪日期截至2018年12月31日，隨訪期間記錄患者生存、死亡情況，死亡患者以最后1次隨訪日期作為截止日期，隨訪結束后統計5年總體生存率(OS)。

2 結果

2.1 DLBCL組織中AXIN2蛋白表達 DLBCL組織中AXIN2蛋白陽性表達26例(23.64%，26/110)，其中8例(30.77%，8/26)為GCB型，18例(69.23%，18/26)為non-GCB型，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 DLBCL組織中AXIN2蛋白表達情況(En Vision兩步法染色×400);A DLBCL組織中AXIN2陰性表達；B GCB型DLBCL組織中AXIN2陽性表達；C non-GCB型DLBCL組織中AXIN2陽性表達

2.2 不同組織中miR-103、AXIN2 mRNA表達水平比較 DLBCL組織miR-103表達水平明顯高于對照組淋巴結組織(P<0.05)，AXIN2 mRNA表達水平顯著低于對照組淋巴結組織(P<0.05)。見表2。

表2 不同組織中miR-103、AXIN2 mRNA表達水平比較

2.3 DLBCL組織miR-103、AXIN2 mRNA表達與臨床特征關系 miR-103表達與年齡、性別及β2-MG水平無關(P>0.05)，與DLBCL患者Ann Arbor分期、IPI評分、LDH水平及Hans分型有關(P<0.05)；AXIN2 mRNA表達與年齡、性別及LDH、β2-MG水平無關(P>0.05)，與DLBCL患者Ann Arbor分期、IPI評分、Hans分型有關(P<0.05)。見表3。

表3 DLBCL組織miR-103、AXIN2 mRNA表達與臨床特征關系 例

2.4 DLBCL組織miR-103與AXIN2 mRNA表達相關性 DLBCL組織miR-103與AXIN2 mRNA表達呈負相關(r=-0.515，P<0.05)。見圖2。

圖2 DLBCL組織miR-103與AXIN2 mRNA表達的相關性

2.5 miR-103與AXIN2 mRNA表達與DLBCL患者5年OS關系 110例DLBCL患者5年OS為53.64%(59/110)。miR-103低表達患者5年OS(64.91%)顯著高于高表達患者(41.51%)(P<0.05)；AXIN2 mRNA高表達患者5年OS(65.57%)明顯高于低表達患者(38.78%)(P<0.05)。見圖3。

圖3 miR-103與AXIN2 mRNA表達與DLBCL患者OS關系

2.6 影響DLBCL患者預后的因素分析 COX回歸單因素分析可知，Ann Arbor分期、IPI評分、Hans分型、miR-103及AXIN2 mRNA表達是影響DLBCL患者預后的不良因素(P<0.05)。進一步多因素分析可知，Hans分型、miR-103及AXIN2 mRNA表達均是影響DLBCL患者預后的危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 COX回歸分析影響DLBCL患者預后的因素

3 討論

DLBCL發病原因與免疫功能異常、細菌感染等因素有關，是一種多基因參與的復雜過程。目前，雖然部分DLBCL患者通過治療可痊愈，但多數患者治愈后復發率高，且復發后死亡率較高，這可能與DLBCL本身具有很強異質性有關。因此，應繼續尋找與DLBCL發生、發展相關因子，以提高患者遠期生存率。既往研究報道，miR-103、AXIN2異常表達與肺癌、結腸癌等多種疾病臨床病理參數及預后有關[7,8]，因此有望成為治療及評估DLBCL患者預后的新靶點。

miRNA是一類內源性非編碼RNA，在細胞分化及腫瘤發生、發展中扮演著重要角色。有研究發現淋巴瘤中miRNA異常表達比其他腫瘤更為明顯[9]，這提示miRNA與淋巴瘤發生、發展有關，因此研究DLBCL中miR-103表達具有臨床意義。miR-103是miRNA中重要一員，首先發現于人宮頸癌HeLa細胞系中，其廣泛存在于人類多種腫瘤組織中，且表達穩定[10]。Ke等[11]研究發現，結腸直腸癌患者miR-103表達上調，miR-103異常表達與細胞增殖、遷移有關。Zheng等[12]研究報道，miR-103在胃癌組織中高表達，其過表達與胃癌患者腫瘤大小及淋巴結轉移有關，且生存分析結果顯示miR-103高表達者總生存率較低。本研究結果發現，DLBCL組織miR-103表達水平遠高于對照組淋巴結組織，與Ke等[11,12]研究結果相似，提示miR-103可能與DLBCL發生、發展有關；且miR-103與DLBCL患者Ann Arbor分期、IPI評分、LDH水平及Hans分型有關，進一步提示miR-103異常表達可能參與DLBCL發展進程。

AXIN是一類多功能構架蛋白，其在胚胎發育過程中可影響體軸形成，并與某些腫瘤的病情進展有關。AXIN2又稱Conductin或Axil，位于人染色體17q23-24。相關研究發現，AXIN2異常表達與多種腫瘤的生物學特性及患者遠期生存率有關[13,14]，因此研究AXIN2在DLBCL中表達對提示預后具有重要意義。Hu等[15]研究報道，前列腺癌組織中AXIN2低表達與患者腫瘤生長及術后復發有關，提示檢測AXIN2表達可為前列腺癌患者臨床治療及預后提供幫助。本研究中，DLBCL組織中AXIN2蛋白陽性表達率為23.64%，non-GCB型明顯高于GCB型，且DLBCL組織AXIN2 mRNA表達水平遠低于對照組淋巴結組織，提示AXIN2可能與DLBCL發生及臨床分型有關。進一步研究發現，AXIN2 mRNA表達與DLBCL患者Ann Arbor分期、IPI評分、Hans分型有關，與Hu等[15]研究類似，提示AXIN2可能在DLBCL發生、發展中扮演著重要角色。本研究還發現，DLBCL組織miR-103與AXIN2 mRNA表達呈負相關，與Chen等[16]報道microRNA-544可通過調控AXIN2表達促進人骨肉瘤細胞增殖相似，推測miR-103可能靶向調控AXIN2表達。生存分析結果發現，miR-103低表達者、AXIN2 mRNA高表達者5年OS較高，提示miR-103、AXIN2異常表達可能與DLBCL患者遠期生存、死亡情況有關；且二者表達均可獨立影響DLBCL患者預后情況，進一步提示miR-103、AXIN2表達可作為DLBCL患者預后評估的重要分子標記物。

綜上所述，DLBCL組織中miR-103表達上調、AXIN2表達下調，其異常表達與DLBCL患者Ann Arbor分期、Hans分型等臨床特征及預后有關，可作為臨床治療DLBCL及評估預后的新靶點。本研究未分析淋巴結反應性增生患者術后5年OS，且miR-103、AXIN2兩因子間相互作用對DLBCL發生、發展的影響未深入探討，接下來應加大樣本量繼續研究。