VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin在妊娠高血壓患者血清及胎盤中的表達水平研究

朱萍 沈萍

妊娠高血壓屬于一種常見的妊娠期并發癥，主要在妊娠20周后出現，嚴重威脅母嬰健康，會造成孕婦和胎兒死亡[1]。產婦的主要臨床表現為高血壓、水腫，嚴重的患者會引發昏迷、抽搐等，會提高母嬰死亡率[2]。目前臨床中關于妊娠高血壓發病相關機制并不明確，妊娠高血壓做到及早診斷和治療，對患者來說至關重要。有研究指出妊娠高血壓會導致血管內皮細胞損傷，從而造成多種器官和系統受到損害，主要是增加血管通透性[3]。VEGF具有促進血管發生以及維持血管內皮細胞功能的作用，在研究妊娠高血壓嚴重程度中具有重要意義[4]。ESM-1屬于一種新型的與內皮功能紊亂有關的標志物，在研究心血管疾病中關注越來越廣泛[5]。ACE作為一種血管緊張素轉換酶，對血管緊張素Ⅱ合成有促進作用，同時起到擴張血管降壓，對平滑肌細胞生長起到抑制作用[6]。Vaspin是一種脂肪因子，主要是由胎盤分泌。本文旨在研究VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin在妊娠高血壓患者血清及胎盤中的表達水平，對研究妊娠高血壓的發病機制具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年8月至2018年8月在我院就診的妊娠高血壓患者30例為妊娠高血壓組，年齡25～35歲，平均年齡(28.6±2.4)歲；孕周34～40周，平均孕周(36.9±4.5)周?；颊呔系?版《婦產科學》的診斷標準，輕度妊娠高血壓8例，中度妊娠高血壓10例，重度妊娠高血壓12例。選取30例在我院體檢的正常妊娠產婦為正常組，年齡22～33歲，平均年齡(27.8±3.6)歲；孕周34～41周，平均孕周(37.2±4.3)周。妊娠高血壓組和正常組患者年齡、孕周等一般資料比較中差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：所有研究對象符合妊娠期高血壓的診斷標準。

1.2.2 排除標準：原發性高血壓患者；糖尿病、心臟病患者；合并腫瘤、感染、自身免疫系統疾病患者。本文研究患者及其家屬均知情，簽署知情通知書。

1.3 方法

1.3.1 標本采集:采集分娩產婦的胎盤組織，產婦分娩后，剪取適量的胎盤組織，用0.9%氯化鈉溶液將殘留的血液清洗干凈，后用濾紙將組織上的水分吸干，在凍存管中保存。抽取研究對象分娩前清晨空腹靜脈血3 ml，放置在干凈的EP管中，經過冷凝處理后，用離心機以2 500 r/min的速度分離，取上層血清保存至-70℃的冰箱中，冷藏待測。

1.3.2 免疫組化染色處理:將石蠟切片樣本放在二甲苯中脫蠟處理10 min，將二甲苯更換后再放置10 min，然后梯度酒精水化；加入蛋白酶修復液，在37℃的恒溫冰箱中孵化30 min，棄抗原修復液；切片移入濕盒中加入濃度為3%的H2O2，去過氧化物酶封閉液，恒溫冰箱孵育10 min，采用PBS淋液沖洗；加入適量的山羊血清，在室溫環境下封閉30 min；用濾紙將封閉液吸取，加入一抗，放入濕盒，然后再加入二抗，室溫孵育1 h，采用PBS淋液沖洗；經過DAB顯色處理10 min，能夠在顯微鏡下觀察到棕黃色陽性反應，則采用PBS淋液沖洗1 min；使用蘇木精復染3 min，然后用濃度為1%的鹽酸乙醇分化處理，自來水沖洗1 min后，脫水并封片處理。

1.3.3 酶聯免疫吸附試驗檢測VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin表達:將采集到的標本，取包被液(pH值9.5 0.05 mol/L CB)適當稀釋的抗VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin 0.1 ml，添加至聚苯乙烯反應板孔中，加蓋后溫度4℃ 24 h，次日使用洗滌劑洗滌3次后，甩干。在各孔中加入稀釋液(pH值7.4的0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液)稀釋的待測標本0.1 ml，同時加入陽性和陰性的對照標本，在43℃置60 min，將液體移除洗滌3次后，甩干。在各孔中加入VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin的酶標抗體0.1 ml，43℃置60 min。液體移去后洗滌3次，甩干。在各個空中加入底物液(0.1 mol/L Na2HPO4(Na2HPO4·12H2O 35.8 g/L)5.14 ml,0.05 mol/L枸櫞酸(10.5 g/L)4.86 ml混勻,加入鄰苯二胺(OPD)4 mg，置棕色小瓶中,臨用時加30% H2O24.0 μl,混勻)0.1 ml，置黑20 min，在各孔中加入2 mol/L H2SO40.05 ml，終止反應。在酶標儀上讀取A405吸收值。分析VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin水平。

1.3.4 陽性表達結果判定:每個樣本在鏡頭下隨機選擇5個視野，VEGF蛋白陽性細胞數<20%顯示為陰性，SASH1蛋白陽性細胞數≥20%顯示為陽性。ESM-1、ACE、Vaspin在血管內皮細胞胞漿以及細胞核中顯示棕黃色顆粒為陽性，陽性細胞數<5%為陰性，陽性細胞數≥5%為陽性。所有病理切片均由2位以上經驗豐富的醫師進行確診。

2 結果

2.1 2組血清VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin表達水平比較 妊娠高血壓組血清中VEGF、ESM-1、ACE和Vaspin表達水平高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組血清中VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin水平比較

2.2 2組胎盤組織中VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin陽性表達率比較 妊娠高血壓組胎盤組織中VEGF、ESM-1、ACE和Vaspin陽性表達率高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 2組胎盤組織中VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin陽性表達率比較 n=30,例(%)

圖1 VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin在妊娠高血壓和正常孕婦胎盤中的陽性表達(免疫組化染色×200)；A正常孕婦VEGF表達；B妊娠高血壓VEGF表達；C正常孕婦ESM-1表達；D妊娠高血壓ESM-1表達；E正常孕婦ACE表達；F正常孕婦ACE表達；G正常孕婦Vaspin表達；H正常孕婦Vaspin表達

2.3 VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin陽性表達與妊娠高血壓嚴重程度的關系 重度妊娠高血壓患者VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin陽性表達率高于輕度妊娠高血壓患者和中度妊娠高血壓患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同嚴重程度患者VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin陽性表達率比較 例(%)

2.4 VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin陽性表達與患者高血壓家族史的關系 有高血壓家族史患者VEGF、ESM-1、ACE、Vaspin陽性表達率高于無高血壓家族史患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 有無高血壓家族史患者VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin陽性表達率比較 例(%)

2.5 VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin之間相關性比較 VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin間進行相關性分析，VEGF與ESM-1間呈正相關(r=0.373,P=0.043)；VEGF與ACE間呈正相關(r=0.369,P=0.044)；VEGF與Vaspin之間呈正相關(r=0.479,P=0.007)；ESM-1與ACE間呈正相關(r=0.409,P=0.025)；ESM-1與Vaspin間呈正相關(r=0.481,P=0.004)；ACE與Vaspin間呈正相關(r=0.448,P=0.013)。見圖2。

圖2 VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin間相關性分析

3 討論

妊娠高血壓綜合征發病主要受胎盤缺血，血管內皮損傷的影響，血管內皮細胞損傷是引起妊娠高血壓的主要原因[7]。有研究指出，全身血管痙攣以及血管內皮損傷會導致妊娠高血壓患者的病理生理發生改變[8]。

本研究結果顯示，妊娠高血壓患者血清中VEGF水平和胎盤組織中VEGF表達高于正常組，本文研究結果與Kemse等[9]研究保持一致。相關研究指出，在妊娠高血壓綜合征患者血漿中VEGF水平較高，會對血管內皮正常生長發育產生影響，增加縮血管因子產生，減少舒血管因子數量，患者會出現不同程度的蛋白尿、高血壓等癥狀，并且發生病理改變[10,11]。高血壓內皮功能紊亂主要有內皮損傷和氧化應激的參與，血管內皮可以產生較多的生物活性物質，在調節血管功能以及結構形成過程中發揮著重要中作用[12]。ESM-1是一種新型的內皮功能紊亂標志物，參與細胞粘附、遷移和增殖過程[13]。本研究結果顯示，妊娠高血壓患者血清中ESM-1水平高于正常組。說明ESM-1可能參與妊娠高血壓的發展。與Hentschke等[14]研究結果保持一致。

妊娠高血壓疾病發生的可能作用機制與胎盤滋養層細胞的缺血缺氧有關，內皮細胞損傷會導致機體中NO、PG因子水平降低，同時內皮素、血栓素A2水平升高[15]。項舟弘等[16]研究指出腎素-血管緊張素系統在妊娠高血壓疾病中具有重要意義。本研究結果顯示，妊娠高血壓組血清中ACE水平以及胎盤組織中ACE表達均高于正常組。說明ACE參與妊娠高血壓發病。有實驗得出，Vaspin在人的胎盤組織有表達，并且咋早期妊娠中Vaspin主要在胎盤細胞滋養細胞以及合體滋養細胞表現，到妊娠晚期，Vaspin只在合體滋養細胞中表達，在早期表達水平較低，在晚期妊娠中顯示高峰[17]?；翮萚18]也在研究中指出，Vaspin基因及其蛋白在妊娠糖尿病患者胎盤組織中顯示高表達，本研究結果與其保持一致。

本研究結果顯示，VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin表達與妊娠高血壓患者嚴重程度有關，并且重度妊娠高血壓患者VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin表達表達較高。賈春文等[19]在研究中指出，妊娠高血壓疾病患者胎盤組織中ACE基因表達較高，并且重度妊娠高血壓患者ACE基因表達高于輕度和中度患者。本研究結果顯示，有高血壓家族史患者VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin表達相對較高。說明VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin表達與妊娠高血壓患者有無高血壓家族史有關。本文通過VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin之間的相關性研究得出，VEGF、ESM-1、ACE、Vaspin之間呈正相關，說明VEGF、ESM-1、ACE、Vaspin參與妊娠高血壓發病過程，隨病情發展，VEGF、ESM-1、ACE、Vaspin表達逐漸升高。

綜上所述，VEGF、ESM-1、ACE及Vaspin在妊娠高血壓患者血清及胎盤中顯示高表達，與妊娠高血壓的嚴重程度和有無高血壓家族史有關，四項因子之間呈正相關，在妊娠高血壓發展中具有重要意義。