黃芪甲苷對尿酸鈉誘導的大鼠急性痛風性關節炎的防治作用及炎性反應機制研究

楊大興 單延具 張欣亮 王雷

急性痛風發作是一種顯著的炎性反應，通常出現在關節中。炎癥過程是由周圍組織中尿酸鈉晶體的沉積引發的。臨床上，痛風與關節的水腫、紅斑以及嚴重的疼痛有關[1-3]。研究表明，尿酸鈉的關節內注射引起的癥狀與臨床痛風癥狀相似。尿酸鈉的關節內注誘發關節腫脹，跛行和傷害感受行為，包括機械異常性疼痛和熱痛覺過敏，并且還觀察到中性粒細胞強烈浸潤到關節間隙[4]。中性粒細胞在關節液和滑膜中積聚，產生促炎性介質，引發膜溶解。已經證明尿酸鈉可以上調單核細胞/巨噬細胞中促炎蛋白，誘導炎性因子(IL-2、IL-6、TNF-α)的過表達。Toll樣受體2(toll-like receptor 2，TLR2)在識別激動劑中起重要作用，如炎性產物等[5-7]。TLR2是參與信號轉導的重要跨膜蛋白。核因子最終激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)轉錄因子是TLR2調控下的重要細胞因子，TLR2、NF-кB可調控炎性因子的激活。黃芪甲苷是從黃芪上提取出來的高純度藥物，黃芪多糖中的主要有效成份是多糖和黃芪苷[8,9]。黃芪甲苷可增強機體免疫力、提高機體的抗炎能力。研究發現，黃芪甲苷顯著抑制脂多糖(LPS)刺激的巨噬細胞中的炎性因子iNOS和COX-2的表達，對角叉菜膠誘導的炎癥和慢性收縮性損傷誘導的大鼠神經病變具有顯著的抗傷害作用[10,11]。因此本研究擬重點探討黃芪甲苷對尿酸鈉誘導的大鼠急性痛風性關節炎的防治機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及染毒 SPF級Wistar大鼠(250～300 g)120只，12周齡，體重250～300 g，重慶醫科大學實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(渝)2018-0001]，將大鼠單籠圈養于有機玻璃籠中，并在溫度(22±1)℃，自動控制晝夜循環(12/12 h)的條件下自由獲得的食物和水。大鼠的使用經北京積水潭醫院動物倫理委員會批準。盡量減少動物的痛苦并減少使用的動物數量。在該研究期間，每只大鼠僅使用1次。根據體重隨機分成6組：對照組、模型組、秋水仙堿組(30.0 mg/kg)、黃芪甲苷低劑量組(10.0 mg/kg)、黃芪甲苷中劑量組(20.0 mg/kg)、黃芪甲苷高劑量組(40.0 mg/kg)，每組20只，雌雄各半。

1.2 藥物、儀器及試劑 尿酸鈉(美國Sigma公司，批號：170927)；秋水仙堿(廣州亮化化工有限公司，CAS64-86-8，99.95%，批號：171218)，大鼠用藥量為成人的20 倍；TLR2、NF-кB、IL-2、IL-6、TNF-α Elisa試劑盒(上海樊克生物科技有限公司，批號：171123、180107、171220、171029、171025)；rizol RNA提取試劑和逆轉錄(RT)試劑盒(美國的Invitrogen公司，批號：AH4127)；TLR2、NF-кB RNA定量逆轉錄酶聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒(賽蘭博、中國，批號：171208、171213)；LightCycler TePCR熱循環儀(瑞士Roche公司)。

1.3 方法

1.3.1 尿酸鈉溶液的制備：將1 g尿酸鈉溶解在200 ml 含有6 ml 1 N NaOH的沸水中，再通過加入HCl的方法將最終溶液的pH值調節至7.2。將溶液冷卻并在室溫下攪拌，然后在5℃下儲存過夜。從溶液中過濾出沉淀物，在低溫下干燥并通過250-pm金屬絲網篩分。 然后將尿酸鹽晶體在10%吐溫80的0.9%NaCl溶液中混合。在空氣/O2混合物中用2.5%異氟烷麻醉。

1.3.2 6模型組的制備:對照組、模型組，每天給予腹腔注射0.9%氯化鈉(3 ml/kg)，持續7 d；秋水仙堿組(30.0 mg/kg)、黃芪甲苷低劑量組(10.0 mg/kg)、黃芪甲苷中劑量組(20.0 mg/kg)、黃芪甲苷高劑量組(40.0 mg/kg)每天給予腹腔注射相應藥物，持續7 d。模型組、秋水仙堿組、黃芪甲苷各劑量組將制備的尿酸鈉注射到右踝關節中誘導急性痛風，對照組注射0.9%氯化鈉溶液。試驗結束后，進行大鼠關節炎癥的積分(注射后6 h分別對6組大鼠進行評定關節炎癥積分)

1.4 機械痛閾(paw withdrawl mechanical threshold，PWT)及熱刺激潛伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)的測定 6組大鼠處死前，根據文獻方法測定PWT、PWTL[12]。

1.5 TLR2、NF-кB在膝關節滑膜組織中表達的測定 使用Trizol Reagent從膝關節滑膜組織中提取總RNA。將750 μl TrizolLS試劑(Invitrogen)與250粉碎的膝關節滑膜組織混合。渦旋混合30 s后靜置5 min，加入200 μl氯仿。將Trizol-氯仿混合物渦旋混合15 s，然后在4℃以12 000×g離心15 min。將上層水相轉移到新管中。最后，按照制造商的說明提取RNA。使用Smart Spec Plus分光光度計(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)定量總RNA。A260/A280比率用于評估RNA純度。 RT和qPCR試劑盒(Takara，大連)，TLR2的引物序列為：5’-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3’(正向)和5’-AGAGCACCAAGACTGGCTCT-3’(反向)；NF-кB的引物序列為：5’-CTTAGTCTTTGTCTGGTACG-3’(正向)，5’-CCTTTGAAAGTCGTTCGACCCTGAGT-3’(反向)。實時PCR一式三份進行，并計算TLR2、NF-кB的相對表達使用比較循環閾值(CT)(2-ΔΔCT)方法，以甘油醛3磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內源對照來標準化數據，引物序列為：5’-GTACTCT

GTTTGACGTCGACT-3’(正向)和5’-CCTCGATTATAGACTATCTGA-3’(反向)。并使用公式2-ΔΔCT計算TLR2、NF-кB的相對表達量。其中ΔCT=(CT TLR2/NF-кB-CT GAPDH)。

1.6 ELISA測定大鼠膝關節滑膜組織中TLR2、NF-кB、IL-2、IL-6、TNF-α蛋白水平 酶聯免疫吸附法檢測膝關節滑膜組織中TLR2、NF-кB、IL-2、IL-6、TNF-α蛋白水平，具體操作見試劑盒說明書。

2 結果

2.1 黃芪甲苷對大鼠PWT、PWTL、關節炎癥積分的影響 模型組PWT、PWTL評分低于對照組，關節炎癥積分高于對照組(P<0.05)；黃芪甲苷各劑量組PWT、PWTL評分高于模型組，關節炎癥積分低于模型組(P<0.05)，且隨著黃芪甲苷給藥劑量的增加，PWT、PWTL評分逐漸升高，關節炎癥積分逐漸降低(P<0.05)；黃芪甲苷低、中劑量組PWT、PWTL評分低于秋水仙堿組，關節炎癥積分高于秋水仙堿組(P<0.05)；高劑量組PWT、PWTL評分、關節炎癥積分與秋水仙堿組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 黃芪甲苷對大鼠PWT、PWTL、關節炎癥積分的影響

2.2 黃芪甲苷對6組大鼠踝關節滑膜結構的影響 對照組踝關節滑膜組織結構正常(約1～3層)，無炎性細胞浸潤；模型組滑膜增厚，滑膜細胞排列紊亂，大量中性粒細胞浸潤；秋水仙堿組及黃芪甲苷組高劑量組關節滑膜結構較為完整，炎性反應較模型組輕，伴少量壞死滑膜細胞壞死，中性粒細胞為少量、分散浸潤；黃芪甲苷組中、低劑量組較模型組而言，踝關節壞死滑膜細胞減少，炎性細胞浸潤減少。見圖1。

圖1 黃芪甲苷對6組大鼠踝關節滑膜結構的影響(HE染色×400)；A 對照組；B 模型組；C 秋水仙堿組；D 黃芪甲苷低劑量組；E 黃芪甲苷中劑量組；F 黃芪甲苷高劑量組

2.3 6組大鼠踝關節滑膜TLR2、NF-кB mRNA表達水平比較 模型組關節TLR2、NF-кB mRNA表達水平高于對照組(P<0.05)；黃芪甲苷各劑量組TLR2、NF-кB mRNA表達水平低于模型組(P<0.05)，且隨著黃芪甲苷給藥劑量的增加，TLR2、NF-кB mRNA表達水平逐漸降(P<0.05)；黃芪甲苷低、中劑量組TLR2、NF-кB mRNA表達水平高于秋水仙堿組(P<0.05)；高劑量組TLR2、NF-кB mRNA表達水平與秋水仙堿組差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 6組大鼠踝關節滑膜TLR2、NF-кB mRNA表達水平比較

2.4 6組大鼠踝關節滑膜TLR2、NF-кB 蛋白表達水平比較 模型組關節TLR2、NF-кB 蛋白表達水平高于對照組(P<0.05)；黃芪甲苷各劑量組TLR2、NF-кB 蛋白表達水平低于模型組(P<0.05)，且隨著黃芪甲苷給藥劑量的增加，TLR2、NF-кB 蛋白表達水平逐漸降低(P<0.05)；黃芪甲苷低、中劑量組TLR2、NF-кB 蛋白表達水平高于秋水仙堿組(P<0.05)；高劑量組TLR2、NF-кB 蛋白表達水平與秋水仙堿組差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 6組大鼠踝關節滑膜TLR2、NF-кB 蛋白表達水平比較

2.5 6組大鼠踝關節滑膜IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表達水平比較 模型組關節IL-2、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平高于對照組(P<0.05)；黃芪甲苷各劑量組IL-2、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平低于模型組(P<0.05)，且隨著黃芪甲苷給藥劑量的增加，IL-2、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平逐漸降低(P<0.05)；黃芪甲苷低、中劑量組IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表達水平高于秋水仙堿組(P<0.05)；高劑量組IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表達水平與秋水仙堿組差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 6組大鼠踝關節滑膜IL-2、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平比較

3 討論

痛風是一種醫學病癥，通常以急性炎癥性關節炎的反復發作為特征，臨床上表現關節，特別是大腳趾關節觸痛、灼熱、腫脹。痛風性關節炎的明確診斷是基于滑液或痛風中尿酸晶體的鑒定。尿酸晶體是最有效的促炎刺激物，對高尿酸尿晶體的先天性免疫反應與痛風性關節炎的病理學密切相關[12,13]。尿酸微晶體對炎癥細胞活化是急性痛風性關節炎的核心特征，促炎性微晶可以與所有主要的滑膜細胞類型相互作用，包括中性粒細胞，單核細胞/巨噬細胞和成纖維細胞樣(B型)滑膜細胞。在單核細胞中，尿酸晶體刺激許多促炎細胞因子的合成，如IL-1，IL-6，IL8和TNF-α。研究已發現，痛風關節炎患者的血清中TNF-α、IL-1β等細胞炎性因子過表達，并與急性和慢性關節炎疾病有關。在與宿主細胞接觸后，尿酸晶體誘導一系列膜事件，其觸發相關的信號傳導途徑，吞噬作用和細胞因子產生。進入細胞后，尿酸晶體進一步引發炎癥小體激活并誘導TNF-α和IL-1β的產生，誘發全譜炎癥。單核細胞/巨噬細胞對尿酸晶體晶體吞噬作用后的TNF-α、IL-1β等在炎性反應的起始和傳播中起重要作用。黃芪甲苷能抑制脂質過氧化，發揮抗炎癥活性，并表現出抗潰瘍作用。

本次研究結果顯示，黃芪甲苷各劑量PWT、PWTL評分高于模型組，關節炎癥積分低于模型組，這說明黃芪甲苷能明顯降低尿酸鈉誘導的大鼠急性痛風性關節炎疼痛。結合病理學研究結果，對照組踝關節滑膜組織厚度正常，滑膜細胞分布均勻且排列整齊(約1～3層)，無炎癥細胞浸潤；模型組滑膜增厚，滑膜細胞排列紊亂，大量中性粒細胞浸潤；秋水仙堿組及黃芪甲苷組高劑量組關節滑膜結構較為完整，炎性反應較模型組輕，伴少量壞死滑膜細胞壞死，中性粒細胞為少量、分散浸潤；黃芪甲苷組中、低劑量組較模型組而言，踝關節滑膜局部粗糙不平，壞死滑膜細胞減少，炎癥細胞浸潤減少。這說明，黃芪甲苷能抑制尿酸鈉誘導的大鼠急性痛風性關節炎。

TLRs是先天免疫受體，其通過檢測病原體及外源性化合物的常見分子結構來保護宿主免受微生物感染或外源性毒物的攻擊。在十個人TLR亞家族成員中，識別其與TLR1或TLR6相關的配體；這些配體主要是外源性化合物分子，如脂肽，脂磷壁酸和肽聚糖[14,15]。TLR2在前哨免疫細胞中表達，包括樹突狀細胞，單核細胞和巨噬細胞。TLR2由一個配體結合胞外域，跨膜結構域和Toll/IL-1受體結構域，啟動下游信號級聯。然后TLR信號激活NF-κB和激活蛋白-1(AP-1)，這兩者都進一步誘導促炎細胞因子。 NF-κB是一種關鍵的核轉錄因子，通常由p50和p65亞基組成。 已經有研究確定NF-κB調節促炎性細胞因子的表達，因此在免疫和炎性反應中具有重要作用[16-18]。本次研究結果顯示，模型組關節TLR2、NF-кB mRNA、蛋白表達水平高于對照組；黃芪甲苷各劑量組TLR2、NF-кB mRNA、蛋白表達水平低于模型組，且隨著黃芪甲苷給藥劑量的增加，TLR2、NF-кB mRNA、蛋白表達水平逐漸降；黃芪甲苷低、中劑量組TLR2、NF-кB mRNA、蛋白表達水平高于秋水仙堿組；高劑量組TLR2、NF-кB mRNA表達水平與秋水仙堿組無明顯差異。而黃芪甲苷后可抑制IL-2、IL-6、TNF-α 蛋白水平。這說明黃芪甲苷能通過抑制炎癥信號通路TLR2、NF-кB mRNA、蛋白表達水平的表達進而抑制炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α的表達。

綜上所述，黃芪甲苷能明顯抑制尿酸鈉誘導的大鼠急性痛風性關節炎，其機制與黃芪甲苷能通過抑制炎癥信號通路TLR2、NF-кB mRNA、蛋白表達水平的表達進而抑制炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α的表達有關。