伊沙佐米對人胃癌細胞株SGC-7901生物學行為的影響及其機制

姜炅，戴社教，陳芬榮，董蕾，劉欣

西安交通大學第二附屬醫院，西安710000

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其主要治療手段是手術切除[1]。盡管早期胃癌切除術后患者的預后能得到明顯改善，但由于癌細胞的耐藥性及侵襲、轉移能力強等特點，導致胃癌患者的生存率偏低[2,3]。伊沙佐米是一類影響泛素-蛋白酶體系統的小分子靶向藥物，能直接抑制蛋白酶體，從而發揮抗腫瘤作用。臨床隨機對照試驗已證實，伊沙佐米治療復發性多發骨髓瘤效果較好[4,5]，美國、歐洲以及中國均已批準其應用于臨床[6]。近年來研究發現，伊沙佐米可抑制骨肉瘤、結腸癌以及黑色素瘤等惡性腫瘤的進展[7～9]，但其對胃癌的影響尚缺乏研究。2019年3～9月，本研究觀察了伊沙佐米對于胃癌細胞生物學行為的影響，并探討其可能的機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：人胃癌細胞株SGC-7901購于湖南湘雅醫學院。主要藥物及試劑：伊沙佐米購于日本武田公司；Transwell小室購于美國Corning公司，RPMI 1640培養基和胎牛血清均購于美國Gibco公司，TRIzol購于美國Invitrogen公司；兔抗Wnt、β-catenin及NF-κB抗體購于美國Santa Cruz公司，β-actin兔抗購于北京中杉金橋有限公司。

1.2 細胞培養及分組處理 將SGC-7901細胞培養于含有10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養。取對數生長期、狀態良好的SGC-7901細胞，隨機分為12.5 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組和對照組，分別加入終濃度為12.5、25、50、100 μmol/L的伊沙佐米及相同體積PBS。

1.3 細胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。將對數生長期的SGC-7901細胞用0.25%胰酶進行消化，制成密度為1×106/mL的單細胞懸液，以1×104/孔接種于96孔板。將細胞按照1.2進行分組處理，每個濃度設置3個復孔。各組分別于作用24、48、72 h，加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃條件下孵育2 h。采用酶標儀檢測450 nm波長處的光密度(OD)值。

1.4 細胞凋亡能力觀察 采用流式細胞術。取對數生長期的SGC-7901細胞，制成密度為1×105/mL的單細胞懸液，以2×105/孔接種于12孔板。參照1.2進行分組處理，培養24 h后收集細胞，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 細胞遷移、侵襲能力觀察 采用Transwell遷移、侵襲實驗。遷移實驗：取對數生長期的SGC-7901細胞，制成密度為1×105/mL的單細胞懸液，取100 μL加入Transwell上室，參照1.2進行分組處理。Transwell下室加入500 μL的RPMI 1640完全培養基，培養24 h后取出上室，甲醛固定，結晶紫染色。隨機選取5個不同視野，顯微鏡下計數穿膜細胞數，取平均值。侵襲實驗需在濾膜表面涂5 μg Matrigel，其余步驟與遷移實驗相同。

1.6 細胞Wnt、β-catenin、NF-κB蛋白表達檢測 采用Western blotting法。各組分組處理24 h，使用RIPA提取總蛋白，按照蛋白濃度與5×SDS蛋白上樣緩沖液以1∶4混合。煮沸變性后，10% SDS-PAGE分離樣品，將蛋白轉移到PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉2 h，加入Wnt、β-catenin、NF-κB一抗(稀釋比例分別為1∶1 000、1∶1 500、1∶1 500)，室溫孵育2 h；加入辣根過氧化物酶標記的二抗(稀釋比例為1∶2 000)，室溫孵育2 h。暗室中加入ECL試劑,使用Bio-Rad照相系統進行照相，并用其附帶軟件分析條帶灰度值,計算Wnt、β-catenin、NF-κB蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組不同時間點細胞增殖能力比較 隨著時間的延長，各組細胞增殖能力均呈升高趨勢。相同作用時間下，對照組、12.5 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組細胞增殖能力依次降低，兩組間比較P均<0.05。見圖1。

圖1 各組不同時間點的生長曲線(CCK-8法)

2.2 各組細胞凋亡率比較 對照組、12.5 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組細胞凋亡率分別為1.99%±0.83%、6.72%±1.42%、17.79%±2.19%、28.50%±5.18%、60.94%±7.47%，組間兩兩比較P均<0.05。見圖2。

2.3 各組細胞遷移、侵襲能力比較 對照組、12.5 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組遷移實驗穿膜細胞數分別為(827±11)、(623±13)、(477±21)、(385±38)、(192±9)個，侵襲實驗穿膜細胞數分別為(811±35)、(601±15)、(419±22)、(372±13)、(174±21)個，組間兩兩比較P均<0.05。

2.4 各組Wnt、β-catenin、NF-κB蛋白表達比較 對照組、12.5 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組Wnt、β-catenin、NF-κB蛋白相對表達量依次降低，組間兩兩比較P均<0.05。見表1、圖3。

圖2 各組細胞凋亡情況(流式細胞術)

表1 各組Wnt、β-catenin、NF-κB蛋白表達情況

圖3 各組Wnt、β-catenin、NF-κB蛋白表達情況(Western blotting法)

3 討論

伊沙佐米是一類蛋白酶體抑制劑，能直接結合并抑制蛋白酶體，使異常蛋白在細胞內積聚；或可通過減少抑癌基因產物降解，而抑制癌細胞活動，促進癌細胞凋亡[4,5]。Tibullo等[10]研究發現，伊沙佐米能夠促進結直腸癌細胞凋亡，其機制可能是誘導DR5表達上調，導致TRAIL/死亡受體信號通路靶向CRC敏感。目前關于伊沙佐米對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等生物學行為影響的研究較少。本研究結果顯示，相同作用時間下，對照組、12.5 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmmol/L組細胞增殖能力及遷移、侵襲實驗穿膜細胞數均依次降低，細胞凋亡率依次升高；這表明伊沙佐米可抑制SGC-7901細胞增殖、遷移及侵襲，并促進細胞凋亡，且這種影響隨著伊沙佐米濃度的升高而更加明顯。

NF-κB通路可參與細胞凋亡，與腫瘤的發生、發展密切相關。NF-κB作為核轉錄因子，可控制細胞DNA轉錄，并參與細胞對有害刺激的反應。在癌細胞中，NF-κB通常呈過表達[11]。研究發現，NF-κB異常表達可降低免疫系統對癌細胞的清除，并促進癌細胞轉移。此外，NF-κB還可通過調節抗凋亡基因腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)來減少細胞凋亡[12]。研究發現，其他的蛋白酶體抑制劑如硼替佐米等亦能抑制NF-κB表達[13]，推測硼替佐米等抑制蛋白酶體后，NF-κB的上游蛋白IκB降解減少，而IκB可抑制NF-κB活性。此外還有研究認為[14]，NF-κB的前體分子必須經泛素化和蛋白酶體降解后，才可轉變為活性分子，因此抑制蛋白酶體可減少NF-κB生成。Wnt信號通路的關鍵蛋白包括Wnt、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)和β-catenin。Wnt分泌到細胞外，與細胞膜上的受體相互作用并將信號傳遞給細胞，從而抑制GSK-3β生成。β-catenin可以進入細胞核并形成轉錄復合物，同時激活Wnt信號通路的靶基因，如cyclinD1和c-myc，從而促進細胞增殖。另一方面，GSK-3β可通過磷酸化作用促進β-catenin降解，并抑制細胞增殖[15]。本研究結果顯示，對照組、12.5 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組Wnt、β-catenin、NF-κB蛋白相對表達量依次降低，表明伊沙佐米對胃癌細胞生物學行為的影響可能與其抑制Wnt/NF-κB信號通路有關。伊沙佐米的這種作用機制可能是通過減少GSK-3β降解實現的，未來需進一步探討其分子機制。